昆虫激素体外调节家蚕滞育激素受体基因的表达

第２７卷第４期Ｖｏｌ畅２７Ｎｏ畅４江苏科技大学学报（自然科学版）　　Ａｕｇ．２０１３２０１３年８月　　　　　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４８０７．２０１３．０４．０１８

昆虫激素体外调节家蚕滞育激素受体基因的表达

王力刚，朱　娟，王　猛，唐顺明

１

１

１

１，２

，沈兴家

１，２

（１．江苏科技大学，江苏镇江２１２０１８）

（２．中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传改良重点实验室，江苏镇江２１２０１８）

摘　要：为了深入研究家蚕滞育的分子机理，从家蚕基因组中扩增了１３９５ｂｐ和９７２ｂｐ２个不同长度的滞育激素受体基因Ｂｍｄｈｒ启动子片段，以ｐＧＬ３畅０Ｂａｓｉｃ为载体，分别构建荧光素酶报告质粒，利用家蚕细胞瞬时表达系统分析其转录活性以及昆虫保幼激素类似物（ＪＨＡ）、蜕皮激素（２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ）和滞育激素（ＤＨ）对其活性的影响．结果表明：１３９５ｂｐ的Ｂｍｄｈｒ启动子活性显著低于９７２ｂｐ的Ｂｍｄｈｒ启动子，这说明Ｂｍｄｈｒ启动子在－９４１～－１３６４ｎｔ区间存在负调控元件．ＪＨＡ浓度为２，４，６μｇ／ｍＬ时，极显著地增强启动子活性；浓度为１μｇ／ｍＬ时活性显著减弱，而为８μｇ／ｍＬ时则活性极显著减弱．２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ对Ｂｍｄｈｒ启动子活性的影响具有剂量效应，低浓度（１，２μｇ／ｍＬ）时显著增强启动子活性；浓度为４μｇ／ｍＬ时，启动其浓度为１０～４０ｎＭ时，显著增强启动子活性；而当其浓度达到６０ｎＭ时，启动子活性变化不显著．关键词：昆虫激素；家蚕；滞育激素受体；启动子；基因表达调控

中图分类号：Ｓ８８１．２　　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１６７３－４８０７（２０１３）０４－０３９１－０５

子的活性显著减弱；但当浓度继续升高时，启动子活性又极显著增强．ＤＨ对Ｂｍｄｈｒ启动子活性的影响同样具有剂量效应，

Ｉｎｓｅｃｔｈｏｒｍｏｎｅｓｒｅｇｕｌａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ

ｇｅｎｅｏｆｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ

ＷａｎｇＬｉｇａｎｇ，ＺｈｕＪｕａｎ，ＷａｎｇＭｅｎｇ，ＴａｎｇＳｈｕｎｍｉｎｇ

１

１

１

１，２

，ＳｈｅｎＸｉｎｇｊｉａ

１，２

（１．ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２０１８，Ｃｈｉｎａ）

ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２０１８，Ｃｈｉｎａ）

（２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｉｌｋｗｏｒｍａｎｄＭｕｌｂｅｒｒｙＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｓｉｌｋｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）ｄｉａｐａｕｓｅ，ｔｗｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｐｒｏｍｏｔｅｒ

ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，１３９５ｂｐａｎｄ９７２ｂｐ，ｏｆｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅ（Ｂｍｄｈｒ）ｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＧＬ３畅０ｂａｓｉｃｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｐｏｒｔｅｒｐｌａｓｍｉｄｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｏｒｅｉｇｎｉｎｓｅｃｔｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｊｕｖｅｎｉｌｅｈｏｒｍｏｎｅａｎａ－ｌｏｇｕｅ（ＪＨＡ），２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓｏｎｅａｎｄｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅ（ＤＨ）ｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｍｄｈｒｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅａｎａ－ｌｙｚｅｄｉｎＢｍＮｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ１３９５ｂｐｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆ９７２ｂｐｏｎｅ，ｉｍｐｌｙｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎ－９４１ａｎｄ－１３６４ｎｔｏｆＢｍｄｈｒｐｒｏ－ｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎ．ＪＨＡｏｆ２，４ａｎｄ６μｇ／ｍＬｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｂｙ１畅５～２畅１ｆｏｌｄｓ，ｂｕｔＪＨＡｏｆ８μｇ／ｍＬｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｃｄｙｓｏｎｅｏｎｔｈｅＢｍｄｈｒｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｖｅａｌｅｄａｄｏｓａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｆｉｌｅ，ｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｅｃｄｙｓｏｎｅ（１，２μｇ／ｍＬ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｅｃｄｙｓｏｎｅｏｆ４μｇ／ｍＬｓｔｒｏｎｇｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗｈｅｎｅｃｄｙｓｏｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ６μｇ／ｍＬｔｏ８ａｎｄ１０μｇ／ｍＬ，ｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｃｏｖｅｒｅｄａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｇａｉｎ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＤＨｒｅ－ｖｅａｌｅｄａｄｏｓａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｆｉｌｅｔｏｏ，ｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＤＨ（１０，２０ａｎｄ４０ｎＭ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｐｒｏ－ｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＤＨ（６０ｔｏ１００ｎＭ）ｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｎｓｅｃｔｈｏｒｍｏｎｅ；Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ；ｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

收稿日期：２０１３－０３－０８

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１１７２２６６）作者简介：王力刚（１９８６—），男，硕士研究生．

通讯作者：沈兴家（１９６３—），男，研究员，博士生导师，研究方向为分子生物学与生物技术．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｊｓｒｉ＠１６３．ｃｏｍ

　　家蚕是一种重要的经济昆虫和模式生物，家蚕滞育机理研究一直受到学界的关注并取得了重要进［１－３］展．根据自然条件下１年内发生的世代数可将家蚕分为一化性（ｕｎｉｖｏｌｔｉｎｉｓｍ）、二化性（ｂｉｖｏｌｔｉｎｉｓｍ）和多化性品种（ｐｏｌｙｖｏｌｔｉｎｉｓｍ）．不同化性的家蚕发生滞育的情况也不同，家蚕二化性品种的滞育性由遗

［４－６］

传性决定并受上代环境影响．滞育激素（ＤＨ）在

［４－５，７］

，胚胎期决定家蚕胚胎滞育中有着重要作用

２５℃光照处理，至蛹期咽下神经节（ＳＧ）合成和分泌滞育激素ＤＨ，成虫交配后产滞育卵；相反，胚胎期照文献［１０］的方法提取家蚕基因组ＤＮＡ，经浓度和纯度检测后，－２０℃保存备用．１畅３　启动子序列扩增

根据家蚕基因组数据库公布的Ｂｍｄｈｒ序列（Ｂｍ－ｓｃａｆ８４｜ＢＡＢＨ０１０３３４７２畅１），使用Ｏｌｉｇｏ６软

－３′，Ｆ２５′ＣＡＴＧＧＡＣＧＡ－３′，Ｒ５′－件分别在－１４００ｂｐ和－１０００ｂｐ左右设计上游引物，在＋１０ｂｐ处设计下游引物，并分别导入ＫｐｎⅠ和ＢｇｌⅡ酶切位点（下划线部分）：Ｆ１５′１５℃暗催青处理，ＳＧ合成和分泌的ＤＨ少，成虫交

配后产非滞育卵［８］

．研究表明：家蚕滞育激素受体基

因Ｂｍｄｈｒ主要在蛹中期卵巢中表达［７］

，ＤＨ必须与滞育激素受体（ＢｍＤＨＲ）结合，通过调控下游基因的

表达变化才能启动滞育

［６，９］

．但是，目前人们对Ｂｍ－ｄｈｒ表达的调控机制尚不清楚．

为了深入研究家蚕滞育的分子机理，本实验根据家蚕基因组数据库公布的ｓｃａｆＢｍｄｈｒ二化性品种８４｜ＢＡＢＨ０１０３３４７２畅１）设计ＰＣＲ上游序列引物，以家蚕（Ｂｍ－ｂｐ不同长度的（－１３６４“～＋秋丰Ｂｍｄｈｒ３１”ｎｔ基因组ＤＮＡ为模板，克隆了１３９５启动子序列）和９７２ｂｐ，（构建－９４１Ｂｍｄｈｒ～＋３１启动子驱ｎｔ）２个动的荧光素酶基因报告载体，利用家蚕细胞瞬时表达分析系统分析其转录活性和外源昆虫保幼激素类似物（ＪＨＡ）、蜕皮激素（２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ）和滞育激素（ＤＨ）对其活性的影响．

１　实验

１畅１　实验试剂

Ｔｏｐ家蚕二化性品种“秋丰”、宿主菌Ｅ．有荧光素酶基因１０、质粒载体ｐＭＤｌｕｃ）、１８ＢｍＮＴ和细胞株由农业部蚕桑ｐＧＬ３畅０ｂａｓｉｃ载体（ｃｏｌｉ含遗传改良重点实验室保存ｏｎｅ．蜕皮激素２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓ－产并提供由中国农业科学院蚕业研究所附属蚕药厂生Ｓｉｇｍａ生物科技有限公司合成公司；保幼激素类似物；滞育激素（ＭＷ．各种限制性内切酶：２７３１畅（ＪＨＡ）０１）ＺＲ由上海强耀－５１５购自、Ｔａｑ酶ＴａＫａＲａ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ等主要试剂购自基、胎牛血清（大连（）ＦＢＳ有限公司）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ＴＣ－１００试剂购自昆虫细胞培养Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司．荧光素酶检测试剂盒（Ｅ４０３０）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司．核苷酸引物的合成、测序委托上海生工生物有限工程公司完成．１畅２　家蚕基因组ＤＮＡ的提取

取家蚕品种秋丰５龄第３日幼虫后部丝腺，参

以家蚕基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ－３′．

扩增，扩增条件为ｍｉｎ９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃、４５ＰＣＲ，７２℃、２剂盒纯化后克隆到产物经凝胶电泳鉴定和分离ｍｉｎ，２５个循环后７２℃ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，用延伸ｓ，６０℃、１，ＤＮＡ１０进行测序验回收试ｍｉｎ．证．１畅４　载体构建

将测序正确的质粒使用ＫｐｎⅠ－ＢｇｌⅡ内切酶双酶切后电泳，分离纯化获得不同长度的Ｂｍｄｈｒ基因启动子片段，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下克隆到经同样酶消化的Ｔｏｐ１０，筛选出重组质粒ｐＧＬ３畅０ＢａｓｉｃｐＧＬ－Ｂｍｄｈｒ载体中１３６４－，转化ｌｕｃ、ＥｐＧＬ．ｃｏｌｉ－１Ｂｍｄｈｒ畅５　细胞培养９４１－ｌｕｃ，并进行酶切鉴定、转染与瞬时表达

．家蚕细胞系ＢｍＮ参照文献［１１］的方法进行细胞培养传代．细胞用２４孔板培养２４ｈ，转染前去除培养基并用无血清培养基洗涤２次，将１００μＬ含有５μＬ脂质体和１μｇ报告质粒的转染液与１ｍＬ无血清ＴＣ－１００培养基混匀，温育细胞４～５ｈ，除去旧培养基，加入３００μＬ含有１０％ＦＢＳ的ＴＣ－１００培养基ＺＲｄｄＨ５１５、β－，激素处理组更换培养基时加入不同浓度蜕皮激素和ＤＨ，对照组加等体积

２每组实验重复Ｏ，以ｐＧＬ３畅

３次０．ｂａｓｉｃ转染的细胞为空白对照，１畅６　荧光素酶分析

细胞转染７２ｈ后，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ收集细胞，去上清液，按照Ｅ４０３０试剂盒（ｐｒｏｍｅｇａ）的说明裂解细胞．加１００μＬ荧光素酶底物于测定管中ｍｉｎｏＭｅｔｅｒ，然后加入（ＬＵＣ）活性２０（２／２０２０ｓ延迟荧μＬ光的细胞裂解液并混匀，１０光ｓ度读数计），上以相对荧光强度

测定荧光，在素Ｌｕ酶－单位（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｕｎｉｔ，ＲＬＵ）表示［１２］

．平行测定细胞总蛋白浓度，以校正报告质粒的荧光素

酶活性值［１３］

．使用ＳＰＳＳ软件进行差异性分析．

２　结果与分析

２畅１　不同长度Ｂｍｄｈｒ启动子活性比较

经Ｍ１３引物双向测序后，分别得到长度为１３９５ｂｐ和９７２ｂｐ的片段．２个启动子片段分别包含１３６４ｂｐ和９４１ｂｐ的５’上游序列，以及３１ｂｐ的第１外显子部分序列．比对结果表明：克隆的片段与公布

ＢＡＢＨ０１０３３４７２畅１序列一致，说明的Ｂｍ－ｓｃａｆ８４｜

已成功克隆到Ｂｍｄｈｒ启动子片段．

将构建好的报告质粒ｐＧＬ－Ｂｍｄｈｒ１３６４－ｌｕｃ、ｐＧＬ－２畅３　２０－ＯＨ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ对Ｂｍｄｈｒ启动子活性的影响

　　将构建好的报告质粒ｐＧＬ－Ｂｍｄｈｒ－１３６４和ｐＧＬ３畅０ｂａｓｉｃ质粒分别转染ＢｍＮ细胞，转染４～５ｈ后使用β－蜕皮激素浓度为０，１，２，４，６，８和１０μｇ／ｍＬ的完全培养基替换旧培养基．７２ｈ后检测ＬＵＣ活性，并经空载体和总蛋白量矫正，结果见图２．当β－蜕皮激素浓度为０时，Ｂｍｄｈｒ基因启动子的活性为６７７±２４畅３３；当β－蜕皮激素浓度为１，２，６，８，１０μｇ／ｍＬ时，启动子的活性增加极显著（Ｆ＝８５畅８３１，Ｐ＝０畅００１＜０畅０１），分别是浓度为０时的Ｂｍｄｈｒ９４１－ｌｕｃ和ｐＧＬ３畅０ｂａｓｉｃ质粒分别转染ＢｍＮ细胞ｈ，转染４量矫正后收集细胞～５ｈ后使用完全培养基替换旧培养基．７２，结果见表，检测１．ＬＵＣ从表中可看出活性，并经空载体和总蛋白，Ｂｍｄｈｒ－９４１启动子活性明显高于Ｂｍｄｈｒ－１３６４启动子，前者是后者的２畅１倍，这表明Ｂｍｄｈｒ基因转录起始位点上游－９４１～－１３６４ｎｔ区域可能存在负调控元件．

表１　不同长度的Ｂｍｄｈｒ启动子活性

Ｔａｂｌｅ１　ＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｎｇｔｈＢｍｄｈｒｐｒｏｍｏｔｅｒ９４１１４５５±８５畅６３３１３６４

６７７±４６畅７３３

２畅２　ＪＨＡ对Ｂｍｄｈｒ启动子活性的影响

ｐＧＬ后使用保幼激素类似物３畅将０构ｂａｓｉｃ建好质粒分别转染的报告质粒（ＺＲ５１５）ＢｍＮｐＧＬ浓度为细胞－Ｂｍｄｈｒ，转染－１３６４和０，１，２，４，６４～５ｈ和８μｇ／ｍＬ的完全培养基替换旧培养基．７２ｈ后检测ＬＵＣ活性，并经空载体和总蛋白量矫正，结果见图１．当保幼激素类似物浓度为２，４，６μｇ／ｍＬ时，启动子的活性极显著增强（Ｆ＝２畅３８２，Ｐ＝０畅００３＜０畅０１），分别是浓度为０时的２畅０，２畅１和１畅５倍；而当保幼激素类似物浓度为１μｇ／ｍＬ时，启动子活性显著减弱（Ｆ＝０畅８６７，Ｐ＝０畅０２１＜０畅０５），浓度为８μｇ／ｍＬ时，启动子的活性则极显著减弱（Ｆ＝０畅０１９，Ｐ＝０畅００１＜０畅

０１）．

图１　保幼激素类似物对Ｂｍｄｈｒ启动子的活性影响Ｆｉｇ．１　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＪＨＡｏｎＢｍｄｈｒｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ

１畅８，２畅８，１畅２，２畅２，２畅４倍；而浓度为４μｇ／ｍＬ的条件下，启动子活性明显减弱（Ｆ＝２８畅０１２，Ｐ＝０畅０１３＜０畅０５），仅是浓度为０μｇ／ｍＬ时的

８０％．

图２Ｆｉｇ　２０．２－　ＯＨＥｆｆｅｃｔｓ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ对ｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆ２０ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ

－ＯＨＢｍｄｈｒ－ｅｃｄｙｓｏｎｅ启动子的活性影响

ｏｎＢｍｄｈｒ

２畅４　滞育激素对Ｂｍｄｈｒ启动子活性的影响

ｐＧＬ后用滞育激素浓度为３畅将０构ｂａｓｉｃ建好质粒分别转染的报告质粒０做对照ＢｍＮｐＧＬ，１０，２０，４０，６０，８０细胞－Ｂｍｄｈｒ，转染－１３６４４～５和和ｈ１００ｎＭ的完全培养基替换旧培养基．７２ｈ后收集细胞，检测ＬＵＣ活性，并经空载体和总蛋白量矫正，结果见图３，当滞育激素浓度为１０，２０，４０ｎＭ时，启动子的活性显著增强（Ｆ＝９畅４４２，Ｐ＝０畅０３７＜０畅０５），分别是浓度为０的１畅７，２畅３和１畅５倍；而当滞育激素浓度为６０，８０和１００ｎＭ时，启动子活性变化不显著（Ｆ＝０畅４９１，Ｐ＝０畅５２２＞０畅

０５）．

图３　滞育激素对Ｂｍｄｈｒ启动子的活性影响Ｆｉｇ．３　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤＨｏｎＢｍｄｈｒｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ

３　讨论

家蚕滞育激素受体基因的表达具有时空特异

［６］

本实验克隆了２个性，它与家蚕滞育密切相关．

不同长度的Ｂｍｄｈｒ启动子片段，经对体外细胞瞬时表达分析，Ｂｍｄｈｒ基因转录起始位点上游－１３６４～－９４１ｎｔ区间存在负调控元件．在线软件（ｈｔｔｐ：／／ａｌｇｇｅｎ．ｌｓｉ．ｕｐｃ．ｅｓ／ｒｅｃｅｒｃａ／ｍｅｎｕ－ｒｅｃｅｒｃａ．ｈｔｍｌ）和ＤＮＡｓｔａｒ软件分析显示，１３６４ｂｐ的Ｂｍｄｈｒ启动子片段包含启动子基本元件如ＴＡＴＡｂｏｘ、ＧＡ－［３］　顾燕燕，华荣胜，周耐明，等．家蚕滞育激素受体基

因（Ｂｍｄｈｒ）的分子克隆及定量分析［Ｊ］．蚕业科学，２００８，３４（３）：４１７－４２３．

ＧｕＹａｎｙａｎ，ＨｕａＲｏｎｇｓｈｅｎｇ，ＺｈｏｕＮａｉｍｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｉｎｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ，Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ［Ｊ］．Ａｃｔａ

ＳｅｒｉｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００８，３４（３）：４１７－４２３．（ｉｎＣｈｉ－

［４］　ＦｕｋｕｄａＳ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｕｐａｌｂｒａｉｎａｎｄｓｕｂｏｅｓｏｐｈａ－

ｇｅａｌｇａｎｇｌｉｏｎｉｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎ－ｄｉａｐａｕｓｅａｎｄｄｉ－ａｐａｕｓｅｅｇｇｓｉｎｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ［Ｊ］．ＡｎｎｏｔａｔｉｏｎｅｓＺｏｏｌｏｇ－ｎｅｓｅ）

ＴＡ（Ｇ／ｂｏｘＴ），ＴＣＡ还有多个上游调控元件）、Ｅｎ（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）元件、，Ｚｅｓｔｅ如ＥｃＲＥｓ元件、（ＡｎｔＰＰｕＧ元件和ＤＰＥ元件，其中－１３６４～－９４１ｎｔ之间存在２个ＥｃＲＥ元件、１个Ｅｎ元件和１个ＡｎｔＰ元件．Ｅｎ

元件对果蝇某些基因在转录水平有抑制作用［１４］

，由此可推测Ｅｎ元件对Ｂｍｄｈｒ基因的表达也有抑制作用，但这还需进一步实验证实．

在家蚕发育过程中，蜕皮激素单独作用能引起

幼虫到蛹的变态［１５］

．蛹期初期，在家蚕正常雌蛹血

淋巴中蜕皮激素的浓度急骤增加［１６］

，并且Ｂｍｄｈｒ

在此时的转录水平急速上升［６，１７］

，这说明蜕皮激素可能会增强ＯＨＢｍｄｈｒ启动子的活性．但是，当２０不但没有增强反而呈下降趋势－ｅｃｄｙｓｏｎｅ为４μｇ／ｍＬ时，Ｂｍｄｈｒ，其原因则有待进一启动子的活性－步地深入研究量效应ＤＨ，其浓度在对Ｂｍｄｈｒ．

１０启动子活性的影响同样具有剂～４０ｎＭ时，可显著增强启动子活性；当浓度达到６０ｎＭ时，启动子活性变化不显著．这种剂量效应与滞育激素对海藻糖酶基因启

动子调控作用［１８］

是吻合的．

本研究结果为探索Ｂｍｄｈｒ基因的表达调控和阐明家蚕滞育的分子机理积累了实验数据．但是，家蚕体内Ｂｍｄｈｒ基因的真实表达调控情况，还需要在个体水平加以深入研究才能揭示．

参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）

［１］　黄君霆．家蚕滞育分子机制的研究［Ｊ］．蚕业科学，

２００３，２９（１）：１－６．

ｄｉａｐａｕｓｅＨｕａｎｇＪｕｎｔｉｎｇｉｎｔｈｅ．ｓｉｌｋｗｏｒｍＳｔｕｄｉｅｓｏｎ，Ｂｏｍｂｙｘｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｒｉ［Ｊｍｅｃｈａｎｉｓｍ２９（１）：１－６．（ｉｎ］．ＣｈｉｎｅｓｅＡｃｔａ）Ｓｅｒｉｏｆ

ｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００３，－［２］　徐卫华．昆虫滞育研究进展［Ｊ］．昆虫知识，２００８，

４５（４）：５１２－５１７．

ＸｕＢｕｌｌｅｔｉｎＷｅｉｈｕａ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｉｎｓｅｃｔｄｉａｐａｕｓｅＣｈｉｎｅｓｅ）

ｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，２００８，４５（４）：５１２［Ｊ－］．５１７．Ｃｈｉｎｅｓｅ（ｉｎｉｃａｅｎｅｓｅ）Ｊａｐｏｎｅｎｓｅｓ，１９５２，２５（１）：１４９－１５５．（ｉｎＪａｐａ－

［５］　ＨａｓｅｇａｗａＫ．Ｔｈｅｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｏｆｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ，

１３０１．

Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９５７，１７９（４３７５）：１３００－［６］　ＨｏｍｍａＴ，ＷａｔａｎａｂｅＫ，ＴｓｕｒｕｍａｒｕＳ，ｅｔａｌ．Ｇｐｒｏ－

ｔｅｉｎｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＢｏｍｂｙｘ－ｃｏｕｐｌｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅ，ａｎｉｎｄｕｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｄｉａｐａｕｓｅ［Ｊ］．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ３４４（１）：ａｎｄ

３８６－３９３．

［７］　ＫｉｔａｇａｗａＮ，ＳｈｉｏｍｉＫ，ＩｍａｉＫ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ

ｍｏｎｅｏｆａ，ｓａｎｄｗｉｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＥＬＩＳＡｓｙｓｔｅｍｐｒｏｆｉｌｅｔｏｄｅｔｅｃｔｏｆｈｏｒｍｏｎｅｄｉａｐａｕｓｅｌｅｖｅｌｓｈｏｒｉｎ－ｅｇｇｂｙｘａｎｄｍｏｒｉｓｕｂｅｓｏｐｈａｇｅａｌ［Ｊ］．ＺｏｏｌｏｇｉｃａｌｇａｎｇｌｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅｏｆ，２００５，ｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ２２（２）：，２１３Ｂｏｍ－

－

２２１．

［８］　ＦｕｋｕｄａＳ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉａｐａｕｓｅｅｇｇｓｂｙ

ｗｏｒｍｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｔｈｅｓｕｂｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌｏｆｔｈｅＪａｐａｎｇａｎｇｌｉｏｎＡｃａｄｅｍｙｉｎｔｈｅ，１９５１，ｓｉｌｋ－

２７：６７２－６７７．

［９］　ＹａｍａｓｈｉｔａＯ，ＨａｓｅｇａｗａＫａｎｄＳｅｋｉＭ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅ

ｄｉａｐａｕｓｅｏｆｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍｈｏｒｍｏｎｅ，ＢｏｍｂｙｘｏｎｔｒｅｈａｌａｓｅｍｏｒｉａｃｔｉｖｉｔｙＬ［Ｊ］．ＧｅｎｉｎｐｕｐａｌＣｏｍｐｏｖａｒｉｅｓｃｒｉｎｏｌ，１９７２，１８（３）：５１５－２３．

Ｅｎｄｏ－

［１０］　ＢｌｉｎＮ，ＳｔａｆｆｏｒｄＤＷ．Ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ

ｉｃｈｉｇｈＡｃｉｄｓｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈｗｅｉｇｈｔ，９７６，ＤＮＡ３：２３０３ｆｒｏｍｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ－２３０８．

［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅ－［１１］　ＳｕｍｍｅｒｓＭＤ，ＳｍｉｔｈＧＥ．Ａｍａｎｕａｌｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ［Ｍ］．ＵＳＡ：ｖｅｃｔｏｒｓＢｕｌｌｅｔｉｎａｎｄＢ－ＴｅｘａｓｉｎｓｅｃｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

［１２］　ＳｔａｔｉｏｎＺｈａｏ，１９８７，１５５５：１０Ｑｉａｏｌｉｎｇ，Ｓｈｅｎ－Ｘｉｎｇｊｉａ１８，３８，Ｚｈｕ－４６．

Ｌｉａｎｇｊｕｎ，ｅｔａｌ．

ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ［Ｊ］．ｏｆＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔＣＩｂ１ｇｅｎｅｆｕｒｐｒｏｍｏｔｅｒＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇｆｒｏｍｓｉｌｋｗｏｒｍ，２００７，，６２ｃ：８７５－８８０．

［１３］　ＺｈｏｕＹＪ，ＸｉａｏＱＬ，ＺｈａｎｇＺＦ，ｅｔａｌ．Ｆｏｒｅｉｇｎｉｎｓｅｃｔ

ｍｏｔｅｒｈｏｒｍｏｎｅｓｏｆＢｏｍｂｙｘｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｍｏｒｉｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｉｅ－ｉｎ１ｐｒｏｖｉ－－

ｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄｂｉｏ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，６６：１４８８－１４９４．

［１４］　ＳｍｉｔｈＳＴ，ＪａｙｎｅｓＪＢ．Ａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆｅｎ－

ｇｒａｉｌｅｄ，ｓｈａｒｅｄａｍｏｎｇａｌｌｅｎ－，ｇｓｃ－，Ｎκ１－，Ｎκ２－ａｎｄｍｓｈ－ｃｌａｓｓｈｏｍｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｅｄｉａｔｅｓａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，

特征［Ｊ］．蚕业科学，２０１１，３７（２）：２１５－２２３．

品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构ＷａｎｇＬｉｇａｎｇ，ＳｏｎｇＨａｉｔａｏ，ＨｕａｎｇＹｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕ－ｖａｒｉｅｔｙａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｇｅｎｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ

ｅｎｃｅｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉａ－ｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓｉｎｂｉｖｏｌｔｉｎｅＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｅｓｅ）

１９９６，１２２：３１４１－３１５０．１９９１：５１８－５２２．

ＳｅｒｉｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１１，３７（２）：２１５－２２３（ｉｎＣｈｉ－

［１５］　吕鸿声．中国养蚕学［Ｍ］．上海：上海科技出版社，［１６］　张剑韵，黄龙全．桑蚕蛹期以昆虫激素类物质ＭＨ，

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［Ｊ］．蚕桑通ＺｈａｎｇｗｅｉｇｈｔＪｉａｎｙｕｎ，ＨｕａｎｇＬｏｎｇｑｕａｎｔｅｒｖｅｎｉｌｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｉｎｓｅｃｔｃｕｒｖｅｓｈｏｒｍｏｎｅｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｐｕｐａｏｖａｒｙａｆｏｆ－［Ｊ］．ＢｕｌｌｅｔｉｎｈｏｒｍｏｎｅｏｆａｎａｌｏｇＳｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ，１９９４，Ｉｍｉｄａｚｏｌｅｍｏｕｌｔｉｎｇ２５（１）：ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｈｏｒｍｏｎｅ，２６－２８ＣＡｊｕ（ｉｎ

３－Ｃｈｉｎｅｓｅ王力刚，）

宋海韬，黄勇，等．催青温度对家蚕二化性

蚕业科学，２００４，３０（２）：１４７－１５０．

ＳｈｅｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＸｉｎｇｊｉａ，Ｔａｎｇｗｏｒｍ，ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｏｆｔｒｅｈａｌａｓｅＳｈｕｎｍｉｎｇ，ＹｉＹｏｎｇｚｈｕ，ｅｔａｌ．ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｓＢｏｍｂｙｘｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｏｆｄｉａｐａｕｓｅｍａｎｄａｒｉｎａｆｒｏｍｈｏｒｍｏｎｅａｎｄｓｉｌｋｔｒａｎ－

ｏｎ－ｔｈｅｍ－１５０［Ｊ（］．ｉｎＡｃｔａＣｈｉｎｅｓｅＳｅｒｉｃｏｌｏｇｉｃａ）

Ｓｉｎｉｃａ，２００４，３０（２）：１４７

（责任编辑：缪文桦）

［１７］　

昆虫激素体外调节家蚕滞育激素受体基因的表达

作者：作者单位：

王力刚， 朱娟， 王猛， 唐顺明， 沈兴家， Wang Ligang， Zhu Juan， Wang Meng，Tang Shunming， Shen Xingjia

王力刚,朱娟,王猛,Wang Ligang,Zhu Juan,Wang Meng(江苏科技大学,江苏镇江,212018)， 唐顺明,沈兴家,Tang Shunming,Shen Xingjia(江苏科技大学，江苏镇江212018; 中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传改良重点实验室，江苏镇江212018)江苏科技大学学报（自然科学版）

Journal of Jiangsu University of Science and Technology (Natural ScienceEdition) 2013(4)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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3. 顾燕燕;华荣胜;周耐明 家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的分子克隆及定量分析[期刊论文]-蚕业科学 2008(03)4. Fukuda S Function of the pupal brain and suboesopha-geal ganglion in the production of non-diapause and di-apause eggs in the silkworm (in Japa-nese) 1952(01)5. Hasegawa K The diapause hormone of the silkworm,Bombyx mori 1957(4375)

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8. Fukuda S The production of the diapause eggs by transplanting the suboesophageal ganglion in thesilk-worm 1951

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10. Blin N;Stafford D W A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes 1976

11. Summers M D;Smith G E A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell cultureprocedures 1987

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14. Smith S T;Jaynes J B A conserved region of en-grailed,shared among all en -,gsc-,Nκ1-,Nκ2-andmsh -class homeoproteins,mediates active transcriptional repression in vivo 199615. 吕鸿声 中国养蚕学 1991

16. 张剑韵;黄龙全 桑蚕蛹期以昆虫激素类物质MH,JHA,CA3处理后卵巢增重曲线比较 1994(01)

17. 王力刚;宋海韬;黄勇 催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征[期刊论文]

-蚕业科学 2011(02)

18. 沈兴家;唐顺明;易咏竹 家蚕、野桑蚕海藻糖酶基因启动子的特性及其滞育激素的转录调节[期刊论文]-蚕业

科学 2004(02)

引用本文格式：王力刚. 朱娟. 王猛. 唐顺明. 沈兴家. Wang Ligang. Zhu Juan. Wang Meng. Tang Shunming. Shen Xingjia 昆虫激素体外调节家蚕滞育激素受体基因的表达[期刊论文]-江苏科技大学学报（自然科学版）2013(4)