蛋白提取.western

Western Blot操作步骤

1、细胞总蛋白的提取

用胰酶-EDTA 将贴壁生长的细胞消化，用PBS 溶液洗3次，弃去PBS 溶液后，加入适量体积的蛋白提取液（1ml 预冷的Lysis Buffer 加入5μl磷酸酶抑制剂1μl蛋白酶抑制剂和5μl 100Mm PMSF ，三种试剂均放在制冷盒中）后，旋涡振荡器混匀，冰浴振荡15min （将摇床放在冰箱中）。于4℃，12000rpm 离心20min ，收集上清液，分装于Ep 管中（一般每管100ul ），-80℃保存（保存时间短-20℃即可）。可取少量蛋白用于蛋白定量（做比较时一定得定量：考马斯亮蓝染色酶标仪595nm 测光密度）。

2、配制12%分离胶（总体积为7ml ）

配置前先将胶板洗净（肥皂水洗-双蒸水冲-无水乙醇冲），晾干后用封口膜封好底部及侧面（如有凡士林可先涂之再封更保险），放在支架上夹好。

取三蒸水2340ul ，30%丙烯酰胺2800ul ，分离胶buffer 1750ul（小分子量蛋白用15%分离胶：分别为三蒸水1680ul ；30%丙烯酰胺3500ul ；分离胶buffer 1750ul ），SDS 60μl，TEMED （四甲基乙二胺，避光保存） 6μl，10%过硫酸铵（现用现配或4℃避光保存不超过两周）30μl。混匀后，倒入放置好的胶板中。在液面上加一层无水正丁醇，使液面平整。待胶完全凝固后，倒掉正丁醇，用三蒸水冲洗几次，其余液体用滤纸吸净。

3、配制5%浓缩胶（总体积为2ml ）

取三蒸水1100ul ，30%丙烯酰胺333μl，浓缩胶buffer 500ul，SDS 20μl，TEMED 4μl，10%过硫酸铵20μl，混匀后，加在分离胶的上层，插入梳子（注意不要有气泡），待胶凝固。

4、处理蛋白样品

自冰箱中拿出蛋白样品，加入5×上样缓冲液（蛋白样品与缓冲液总量为30ul ：6ul/24ul，如果蛋白量体积够的话，总体积40ul ，marker 用20ul ），将小管盖好盖后用封口膜封好以防止煮沸过程中开盖导致稀释，插在专用有孔泡沫上，在沸水中煮3-5min （锅盖打开）

5、上样

待浓缩胶完全凝固后，将封口膜取下把胶板放于电泳槽中。加入电泳缓冲液（加满），拔出梳子，用微量加样针在各加样孔中加入适量体积的处理过的蛋白样品（加样针先插入底部然后慢慢上移缓慢加样）。若有不用的加样孔，可加入上样缓冲液（如：缓冲液-蛋白样品-marker-缓冲液-蛋白样品-缓冲液，将顺序记在本上）。

6、电泳：接通电源，进行电泳（根据分子量大小设置电压，分子量小采用低电压以降低电泳速度）。一般溴酚蓝跑到底部时结束电泳（因电泳时产热，电泳仪周围最好放置冰袋）。

7、转膜

电泳结束后，将含有目的蛋白的分离胶切割下来，放入转移缓冲液中；根据胶的大小剪裁等面积的6张滤纸（略短于胶1mm ）和1张PVDF 膜（大于20KD 的蛋白勇0.45um 的膜；小于20KD 的蛋白就要用0.2um 的膜），剪裁的PVDF 膜可比胶的长宽各长出1mm 左右。6张滤纸放入转移缓冲液中；PVDF 膜先放入甲醇中活化（不能超过15sec ），再放入转移缓冲液中平衡15min 后（若检测小于20KD 的蛋白缩短或省略平衡步骤），依次在石墨电极上叠放3张滤纸、PVDF 膜、SDS-PAGE 凝胶和另外3张滤纸，用玻璃棒赶出气泡。接通电源，40min ～60min 转膜结束(根据分子量大小定时间，分子量大可增加转膜时间) 。

8、封闭：将转移后的PVDF 膜放入5%脱脂奶粉或1%BSA中（小袋），振荡封闭至少1h 。

9、与一抗结合

用抗体稀释液将一抗按1：1000～2000稀释。将PVDF 膜直接放入一抗稀释液中（小袋），室温振荡孵育2h 或4℃过夜。

10、洗膜：用TBST 洗膜，10min/次，共3次。

11、与二抗结合

将洗后的PVDF 膜放入二抗溶液中，二抗的稀释度为1：2000～5000。室温振荡孵育1h 。

12、洗膜：用TBST 洗膜，10min/次，共3次。

13、化学发光、显影、定影

此操作在暗室中进行。将发光试剂A 和B 等体积混合后加在PVDF 膜的蛋白面上，室温下孵育3min 。将PVDF 膜用保鲜膜包好放在暗盒内（必须保持干燥）。在红灯下取出X 胶片，放在膜上，根据信号的强弱调整曝光时间。曝光结束后取出X 胶片（从30sec 开始试），浸入显影液中显影，显影2～5min ，用水终止显影。然后将X 胶片浸入定影液中，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

14、结果处理：将胶片进行拍照。用凝胶图象处理系统分析目标带的光密度值。

附：用于Western blot实验所需溶液的配制

1、30%丙烯酰胺贮存液：称取14.5g 丙烯酰胺和0.5g N-N-甲叉双丙烯酰胺，将其溶于50ml 三蒸水中，棕色瓶中避光保存。

2、SDS-PAGE 电泳缓冲液：称取14.4g 甘氨酸，3g Tris碱和1g SDS溶于1L 三蒸水中，不用调pH 。

3、分离胶缓冲液（4×） 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8

称取18.15g Tris碱，将其溶于80ml 三蒸水中，用浓盐酸调pH 到8.8（约需浓盐酸4～5ml ），加三蒸水至100ml 。

4、浓缩胶缓冲液（4×） 0.5mol/L Tris-Cl pH6.8

称取6g Tris 碱，将其溶于80ml 三蒸水中，用浓盐酸调pH 到6.8（约需浓盐酸3ml ），加三蒸水至100ml 。

5、10%过硫酸铵：称取0.1g 过硫酸铵溶于1ml 水中。现用现配（或冰箱保存不超过两周）。 6、10%SDS：称取5g SDS溶于50ml 三蒸水中，室温保存。

7、考马斯亮蓝染色液：0.25%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%冰乙酸

称取1.25g 考马斯亮蓝R-250，加入250ml 甲醇，35ml 冰乙酸，补充蒸馏水至500ml ，滤纸过滤后置棕色瓶中保存，可重复使用。

8、考马斯亮蓝脱色液：30%甲醇，7%冰乙酸。（或：甲醇：冰乙酸：ddH 2O=3:1:6）

9、TBST （tris buffer solution with tween-20）：20mmol/L Tris-Cl （pH7.5），500mmol/L NaCl ，0.05%tween-20。

称取Tris 碱1.21g ，NaCl 14.6g，将其溶于500ml 蒸馏水中，加入6～10滴浓盐酸，调pH 到7.5左右，加入250μl tween-20。

10、转移缓冲液：39mM 甘氨酸，48mM Tris碱，0.037%SDS，20%甲醇

称取1.46g 甘氨酸，2.9g Tris碱，0.185g SDS，将其溶于400ml 三蒸水中，加入100ml 甲醇。

11、封闭液：5%脱脂奶粉或1%BSA（用TBS 配制）。现用现配。

12、抗体稀释液：用TBS 配制(亦可用PBS) 。现用现配。