固定化酶载体的研究现状及其应用

湖南林业科技　2007年第34卷第2期

研究报告

固定化酶载体的研究现状及其应用

范友华, 黄　军, 陈泽君

(湖南省林业科学院, 湖南长沙　410004)

摘　要:研制开发性能优异的固定化载体, 已成为固定化酶技术最为活跃的研究方向之一。固定化酶在生物及生物

工程、环境化工、食品、医药等领域得以迅速发展, 其中, 结合现代分析仪器, 固定化酶反应器(I M ER ) 将成为固定化酶应用的一个新领域。本文对近几年来固定化酶载体的制备及固定化酶的应用进行了综述。关键词:固定化酶; 载体; 应用中图分类号:O 631　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1003—5710(2007) 02—0029—03

Research st atus and appli on i i m mobili Zejun

(Academy, Changsha 410004, China )

Abstract:Researching and devel op ing multifuncti onal matrices for i m mobilized enzy mes is considered as one of most activated orients . I m mobilized enzy me has been devel oped in the bi ol ogy, bi otechnol ogy, envir on ments and che m ical engineering, f oods, and bi omedical engineering and s o on . I m mobilized Enzy me React or (I M ER ) would be a ne w field f or the app licati ons of i m mobilized enzy mes when it combines with modern analytical instruments . The current p r ogress in the p reparati ons of matrices f or i m mobilized enzy mes and app lica 2ti on of i m mobilized enzy mes was revie wed in the literature . Key W ords:i m mobilized enzy mes; matrices; app licati on

　　酶的固定化是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一

定的区域内, 但仍能进行酶所特有的催化反应, 并可回收及重复使用的一种新技术。与水溶酶相比, 固定化酶在保持其高效、专一、温和及酶的活性可调节控制等酶催化反应特性以外, 还有分离回收容易、可重复多次使用、操作连续及可控、工艺简便等系列优点, 因此在生物及生物工程、医药、食品、医学及生命科学等相关领域得以迅速发展。经过几十年的研究和发展, 固定化酶技术已取得了长足进步, 在传统固定化酶方法的基础上, 着力研究性能优异的载体材料, 已成为固定化酶技术目前最为活跃的研究方向之一。本文对近几年来固定化酶载体的制备及固定化酶的应用进行了综述。

质, 同时又易于接枝而改性, 再加上其来源丰富, 成本低廉, 制备简单, 已成为开发固定化酶载体材料的方法之一。利用壳聚糖上的氨基与戊二醛发生Schiff 反应, 再与酶形成Schiff 碱而固定化酶。以甲壳胺与羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸的两种氢键复合物为载体固定葡萄糖氧化酶(G OD ) 和纤维素酶。并用透射电镜观察了其结构, 整个复合物固定化酶分子呈纤维状, 且微结构中有供酶存在的空间。最近, 在室温下采用溶液-凝胶法聚合制得了壳聚糖—Si O 2混合物, 用于固定葡萄糖氧化酶, 在pH =5. 6时, 酶活最高, 为1585U /g。30℃下保存10d 后, 酶活力仍保持86%, 而游离酶在同样条件下

[1]

5d 已失活。Ehab Taqieddin 等报道了生物相容性的硅藻盐和壳聚糖核壳型复合载体, 将β—半乳糖酶固定在硅藻盐上, 催化对硝基苯酚的合成, 壳聚糖壳起着漉网的作用, 限制着底物和产物的进出。此外, 其他类天然高分子, 经改性也可用作固定化酶的载体。1. 2　合成高分子类载体的研究1. 2. 1　聚碳酸乙烯撑脂(P VCA ) 载体的研究　自Chen 等将聚碳酸乙烯撑脂(P VC A ) 用双端氨基环醚和乙醇氨进行交联制备酶载体后, 聚碳酸乙烯撑脂(P VCA ) 载体也得到了较好的研究。黄家贤工作组[2]将先合成具有良好生物组织相容

ω

—双端氨基聚乙醇性、不易降解且易于由肾脏排出的α、

1　固定化酶载体的研究

1. 1　天然高分子载体的研究

壳聚糖(Chit osan ) 是甲壳素的脱乙酰化产物, 是一种氨

基多糖。由于壳聚糖具有良好的机械性能、稳定的化学性

收稿日期:2006—12—14

修订日期:2007—01—26

作者简介:范友华(1980-) , 男, 硕士研究生, 助理工程师, 主要从事复合材料的制备、林产化工等方面的研究。

・3

0・

(H 2N —PEG —NH 2) , 再与PCVA 进行交联反应, 得亲水性显著

范友华, 等:固定化酶载体的研究现状及其应用

载体[4]。他们也制备了表面功能化磁性微球, 固定化乳酸

改善的球状载体, 载体与胰蛋白酶进行偶联反应制备了固定酶, 实验结果显示固定化酶的量与磁性微球的量成正比。此

ω(H 2N —PEG —NH 2) 为0. 5时, 酶化胰蛋白酶, 当ω(P VCA ) /外, 用等离子体等高能物理方法也可制得性能优异的载体材

蛋白的比活及其与载体的结合量均到达最高值。料。1. 2. 2　甲基丙烯酸类载体的研究　通过自由基沉淀聚合反1. 4　无机载体的研究应合成甲基丙烯酸—丙稀酰胺—顺丁烯二元酸酐三元共聚物, 无机硅藻土或多孔玻璃比有机载体更耐微生物降解、更利用共聚物上的酸酐基团, 直接进行木瓜蛋白酶的固定化。高热稳定性和更低的价格, 也受到固定化酶工作者的重视。这种固定化酶可通过调节体系的pH 值来改变其沉淀-溶解通过烷基胺与对甲基苯甲酸反应, 直接生成芳胺的衍生物, 状态。研究表明, 共聚物组成不同, 转变的临界pH 值也不同比常用方法缩短了一步。然后用重氮化法固定木蛋白酶, 酶(pH =2～4) , 这样就得到具有游离酶和固定酶两者优点的量为240mmg /g载体。用这种方法合成的载体固定化酶, 其新型固定化酶制剂。甲基丙烯酸缩水甘油酯—N, N ′—亚甲基对热稳定性、操作稳定性及产率都比较理想。在温和条件双(丙烯酰胺) 共聚物载体固定青霉素酰化酶, 可得到高活性下, 将氯化过氧化酶共价固定在功能化硅胶上, 制成了氯化的生物催化剂。Tahsin Bahar 等报道了用悬浮聚合法合成聚生物催化剂, 该酶催化剂与游离酶相比, 表现出良好的催化甲基丙烯酸羟丙酯/甲基丙烯酸水凝胶颗粒, 以此为载体共性, 且固定化酶的稳定性不受pH 值和氧化剂浓度的影价固定α—胰凝乳蛋白酶。最优条件下固定化酶与游离酶相响[5]。共价法将α—淀粉酶固定在粒径为0. 5～10μm 的硅比, 热稳定性显著提高, 且K M 常数是游离酶的2倍多。用悬胶颗粒上, 24h, 可使浓度为浮聚合法合成聚乙烯二甲基丙烯酸乙二醇酯/二乙氧基甲基/mL。值得一提的是, 有文丙烯酯P (EG DMA /HEMA ) 非多孔微球, 以此为载体固定尿素酶。, 。(G MA ) 和亲水的N () , 以N

酶的固定方法—亚甲基双丙稀酰胺(, 合成了亲水性大—元合物载体根据酶的性质及其用途, 酶的固定方法一般有包埋法, (G NM ) [3]。交联法、吸附法、共价结合法, 此外, 还有物理吸附。理想的

孔径为16. 5n m 的G NM 载体上, 制成固定化酰化酶, 其表观载体除应具备符合操作需要的形状、粒度和机械强度, 同时活性高达625U /g。该固定化酶在4℃可保存40d, 且可多其表面还应具有一定数量的与酶结构及固定方法相匹配的次使用。

官能团。如:-OH 、-COO -和-NH 2等。表1中列出了载

1. 2. 3　其他共聚物高分子载体的研究　根据水溶性大分子

体类型及其所带基团和酶的固定方法。

间可通过次级键合力如氢键、静电力和疏水相互作用等形成

表1　部分固定化酶载体上所带基团和固定方法

水不溶性大分子复合物沉淀的性质, 研究了利用这种大分子

酶含有的基团固定方法载　体复合物作为酶的载体, 得到沉淀—溶解性可调节的固定化酶

牛血清蛋白(BS A ) -NH 2交联法聚丙烯酸类树脂载体。如在二乙烯基苯交联下, 丙烯酸胺(AM ) 、丙烯腈

-NH 2抑肽酶共价法壳聚糖微珠(AN ) 的摩尔比为1∶3时, 在65℃经悬浮聚合24h 所得三元

脂肪酶凝胶包埋法AOT 反相凝胶

共聚物, 以其为载体对牛血清白蛋白有最大结合量-尿素酶交联法P (EG DMA /HEMA ) -COO 209. 3mg /g(干) 。通过其它的方法可以得到不同的载体材-辣根过氧化酶包埋法海硅藻钙凝胶-COO

(() ) 料, 如以AOT 二2—乙基己基琥珀酸酯磺酸钠/正庚烷/-NH 2木瓜蛋白酶重氮法共价键法多孔玻璃

-NH 2水/明胶组成的反相微乳凝胶可作为脂肪酶的固定化载体。胰蛋白酶共价法乙烯撑碳酸酯-NH 2, -OH 壳聚糖-Si O 2微珠葡萄糖氧化酶共价法在室温下, 固定化脂肪酶催化棕榈酸和十六醇的酯化反应,

β—牛乳酶物理吸附壳聚糖硅藻微珠

固定化脂肪酶可重复使用16次, 平衡转化率仍可达90%。

　　酶固定化后与游离酶相比, 固定化酶的稳定性(如pH 、由邻苯二酚和4, 4′—亚甲基苯胺合成了一种新的功能聚合

温度、半衰期) 有了较大的提高, 这扩大了酶的使用范围, 显物, 芳香胺—邻醌聚合物。聚合物独特的纳米微观颗粒和孔

示了固定化技术在工业领域应用的潜在价值。穴结构, 使其成为吸附法固定化酶的良好载体。以N —异丙

基丙烯酰胺等合成了温敏型载体聚N —异丙基丙烯酰胺

3　固体化酶的应用(N I P ) 及其衍生物, 采用该类载体代替传统载体, 可在37℃

3. 1　固定化酶的应用进展的生理温度下进行反应, 进一步提高了免疫分析反应的速度

生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系和效率。

统, 能简便的测定各种特异性很强的物质, 在临床检测、工业1. 3　磁性高分子微球类载体的研究

检测等方面得以广泛应用。固定化胆固醇氧化酶装管与氧磁性高分子微球是内部含有磁性金属或金属氧化物(如

传感器, 溶氧仪构成的液流型传感器, 胆固醇检出限为铁、钴、镍及其氧化物) 的超细粉末而有磁响应性的高分子微

5mg /L。采用溶胶凝胶法制备的固定化葡萄糖酶柱, 并应用球, 其制备方法有包埋法、共沉淀法、单体聚合及化学转化

于化学发光型的葡萄糖传感器, 可实现对葡萄糖的在线测法。如利用喷雾干燥法制得粒径分布在1. 0～1. 5μm 之间,

定。线性范围为3. 5～70mol /L,相关系数为0. 999, 检出限磁含量约为15%的聚苯烯腈的磁性微球, 作为固定化酶的

3

1・研究报告・　　　

为0. 6mol /L。阴离子聚合物锇—聚乙烯吡咯(P VP —O S ) 与辣

根过氧化酶(HRP ) 基于静电相互作用而组装的多层膜电极, 酶电极的响应迅速, 使用方便[6]。通过聚赖氨酸修饰将微过氧化物酶—11(MP —11) 固定在金电极表面, 制成M P —11修饰电极。该修饰电极对氧的还原具有电催化活性。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究引起了人们的广泛兴趣。固定化脂肪酶能合成具有解毒镇痛、消炎抗风湿药物(S ) —(+) —布洛芬猪胰脂酸酶在有机相中催化丁酸甲酯和正丁醇的酯交换反应, 效果也十分理想。蛋白酶固定化后也可用于肽键合成及有机化合物酶促反应。壳聚糖固定化胰蛋白酶制备具有多种药用价值的高比活性抑肽酶已显示出工业应用前景。米曲氨基酰化酶拆分D, L —丙氨酸得到光学纯的D 型丙氨酸, 能有效缓解医药工业、食品工业对其的需求压力。随着环境污染日趋严重, 固定化酶在环境保护领域将具有重要作用。凝胶包埋辣根酸过氧化物酶能有效催化氧化去除水溶液中的酚, 对混合酚的处理, 存在明显的协同作用。固定化乙酰胆碱酯酶(AchE ) 对有机磷类及氨基甲酸酯类农药残毒具有较高的检测灵敏度, 可用于食品、环境等领域中微量有机磷化合物的检测[7]。3. 2　固定化酶反应器(I M ER) (I m I M ) 与HP LC 或F I A , 的应用范围。3. 2. 1　I M ER 在高效液相色谱(HP LC ) 的应用　国内学者建立了高效液相色谱分离—柱后固定化酶反应器—电化学检测法, 用于检测乙酰胆碱ACh 和Ch 的含量。在0. 2～100mol /L范围内ACh 和Ch 的浓度与其响度的线性关系良好, 它们的检测限都达50f mol 。用处理过的多孔玻璃珠(CPG ) —10(80—100目) 偶联胆甾醇氧化酶, 制得的填充式反应器用于HP LC, 检测胆甾醇, 灵敏度提高3. 4～4. 4倍。激活后的强酸性阳离子交换剂Partisil 210SCX 吸附葡萄糖氧化酶制成的I M ER, 用于HP LC, 测定血清与全血中的葡萄糖含量, 使用一月后对葡萄糖的响度值仍可达最初响度值的95%, 且无需低温保存。此外, 用戊二醛激活的大孔硅胶再共价固定甘油醇—3—磷酸脱氢酶(G AP DH ) , 然后装入色谱柱中制成填充式固定化酶反应器(G AP DH 2I M ER ) , 用于液相色谱和在线色谱检测系统中。该反应器可在线检测各种寄生疾病, 并在毒品检测中有潜在的应用意义[8]。3. 2. 2　I M ER 在流动注射分析(F I A ) 检测系统中的应用　采用F I A 2I M ER —化学发光法测定人血清中酸含量, 线性范围为400～1000mg /mL,检测下限16mg /mL,且固定化酶柱可重复使用至少700次以上。将乳酸脱氢酶偶联在CPG 上, 用于F I A 测定人体液中L —乳酸, 线性范围在0. 1～4. 4mmol /L, 检测限为0. 4mmol 。采用固定化酶管安培法结合F I A 能快速的测定青霉素的含量, 结果受测定条件的影响小, 精密度高, 且酶管中青霉素酶的活力稳定。

3. 2. 3　I M ER 在其它领域的应用　I M ER 与基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I 2T OF, MS ) 联用技术用于蛋白

质的肽谱分析。该法尤适用于高灵敏度和微量生物样品的快速分析, 可以在皮摩尔的水平对蛋白质的结构进行鉴定[9]。

4　结束语

综上所述, 固定化酶的应用迅速发展。启发于天然高分子载体的特性, 设计合成性能优异的高分子载体材料, 开发新型固定化技术, 是酶固定化研究的主要方向之一。运用现代高科技技术改性载体材料, 用于酶的固定化也显示出良好的开发前景。传统的固定化酶主要应用于生物学及生物工程、医学及生命科学以及化学化工等领域, 而今固定化酶反应器在现代仪器分析中已初步显示出其应用价值, 将成为固定化酶应用的新领域。

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