蛋白质的分离与纯化-xiao

综合实验(1)--蛋白质的分离与纯化

一、实验目的

1、掌握凝胶过滤层析的原理,掌握凝胶柱柱效测定的方法。

2、熟悉凝胶层析的一般过程。

3、了解凝胶介质的选择原则和应用领域。

4、掌握测定蛋白质标准曲线的制作方法。

5、能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法,锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。

6、学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。

7、掌握离子层析的原理以及离子交换层析的操作方法。

8、掌握离子交换树脂的再生和保存。

9、掌握比色法测定酶活。

10、理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE )测定蛋白质浓度与分子量的原理与依据。

11、掌握电泳原理以及SDS-PAGE 垂直板电泳分离蛋白质技术。

12、熟悉垂直板电泳操作原理和方法,凝胶染色与脱色方法,凝胶图谱的绘制与计算。

13、了解在聚丙烯酰胺电泳中分子量标准物的使用。

二、实验原理

(一)蛋白质分离纯化的一般方法

1、沉淀法

沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质,进而导致有效成分的溶解度发生变化。沉淀法大致可以分为一下两种类型。

盐析法。盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升,但当盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

有机溶剂沉淀法。有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二:其一,与盐溶液一样具有脱水作用;其二,有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性减小。

通常有以下几种方法使蛋白质沉淀。

(1)蛋白质沉淀剂

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用,常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

(2)聚乙二醇沉淀作用

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

(3)选择性沉淀法

根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点,用适当的选择性沉淀法,即可使杂蛋白变性沉淀,而欲分离的有效成分则存在于溶液中,从而达到纯化有效成分的目的。

2、吸附层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。

这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。

3、离子交换层析

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

(1)离子交换树脂

离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分很稳定,不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。由于本实验采用的是阳离子交换树脂,所以将其做重点介绍。

阳离子交换树脂具有酸性基团,如葡萄糖凝胶型、琼脂糖凝胶型以及强酸型磺酸型聚苯乙烯树脂等。这种树脂的化学性质很稳定,具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质,因此应用非常广泛。各种阳离子交换树脂含有不同的活性基团,常见的有磺酸基(—SO 3H )和羧基(—COOH) 等。根据活性基团离解出H +的能力的大小不同,阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含—SO 3的为强酸性阳离子交换树脂,常用R —SO 3H 表示(R 表示树脂的骨架),含—COOH 的弱酸性阳离子交换树脂,分别用R —COOH 表示。强酸性阳离子交换树脂应用较广泛,弱酸性阳离子交换树脂的H +不易电离,所以在酸性溶液中不能应用,但它的选择性较高而且易于洗脱。

离子交换反应和其他化学反应一样,完全服从质量作用定律。树脂对离子亲和力的大小,与离子的水和离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明,在低浓度、常温下,离子交换树脂对不同离子的亲和力顺序有下列规律。对于在弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲和力顺序为:Ag +>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+。

根据这些原理我们利用在此条件下溶菌酶的亲和力大于H +,所以弱酸性阳离子交换树脂的活性基团在离子交换过程中可吸附溶菌酶,再采用亲和力更大的Na +进行洗脱就可得到相对纯化的溶菌酶。

同时,为了监测分离纯化的效果,我们必须对相应的结果进行检测。对于酶而言,主要通过其催化特异的反应进行监测。溶菌酶对革兰氏阳性菌的细胞壁有明显的破坏作用,可利用这一特性进行溶菌酶活性的监测,以便我们区分在纯化过程中,含有溶菌酶的组分。

类似的采用DEAE-纤维素对抗体进行精制,特别是经过初步纯化后的免疫球蛋白的纯化,效果尤为显著。IgG 的等电点为pI 8.0,IgM 、IgA 的等电点为pI 7.0、7.4,在pH 8.0时IgG 带正电荷,不能被DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来,被DEAE-纤维素吸附的其他球蛋白,可用逐渐增加洗脱液中PO 43-浓度的方法将其逐一洗脱,或降低pH 使之洗脱出来。

(2)离子交换层析过程

蛋白质进入离子交换柱后,与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。余下的蛋白质均结合在树脂上,利用其蛋白质表面电荷性质的不同,与树脂的亲和力也各不相同,利用不同强度的离子溶液,将其洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。以下对操作过程的要点进行说明。

①离子交换剂预处理和装柱

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经过这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之称为带H +或OH -的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱—酸—碱”处理,使最终转为OH -型或盐型交换剂;对于阳离子交换剂则用“酸—碱—酸”处理,使最终转为H +型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH 和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用。

②加样与洗脱

加样:层析所用的样品应与起始缓冲液有相同pH 和离子强度,所选定的pH 值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度

应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去。为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%~5%。加样蛋白浓度低于20mg/mL,上样体积小于柱体积的1/3。

洗脱:已结合样品的离子交换柱,可通过改变溶液的pH 或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可以同时改变pH 和离子强度。为了使复杂的组分分离完全,往往需要逐步改变pH 或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH 与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH 与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱:两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH 的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH 的缓冲液,两容器连同,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

洗脱时应满足以下要求:a. 洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不致太拥挤;b. 梯度的上线要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来;c. 梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态,目的物过早解吸,会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽;d. 流速1mL/(cm 2,min )左右,过快会吸附不完全,分离不清,洗脱峰平坦。

③洗脱馏分的分析

按一定体积(5~10mL/管)收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱。依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法(生物活性测定、免疫学测定等)确定图谱中目的物的位置,并回收目的物。

④离子交换剂的再生与保存

离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/L NaCl 淋洗柱,若有强吸附物则可用0.1mol/L NaOH 洗柱;若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯己定(洗必泰),阳离子交换剂可用乙

基硫柳汞(0.005%)。有些产品建议用0.02%叠氮化钠。

4、凝胶过滤层析

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。如图9-1所示,是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔,沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过,大分子相对于小分子迁移的路径短,保留值小,所以在层析过程中迁移速度最快,先从柱中流出;反之,分子量小的生物分子保留值大,后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质(包括酶类)核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子,也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的相对分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。

(1)层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验,组别分离时,大多采用20~30cm长的层析柱,分级分离时一般需要100cm 左右长的层析柱,其直径在1~5cm范围内,小于1cm 产生管壁效应,大于5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度,所以样品量大时可采用大直径的层析柱(一般制备用凝胶柱,直

径大于2cm ,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上)。分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过1m 。 ①分组分离时用短柱,一般凝胶柱长20~30cm,柱高与直径的比较5:1~10:1,样品溶液体积应小于凝胶床体积的20%。 ②分级分离时柱高与直径之比为20:1~100:1(层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支撑滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混合的可能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾现象,降低分辨率。在精确分离时,死体积不能超过总床积的1/1000),样品溶液体积应小于凝胶床的5%。③脱盐:高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、

6。柱长与直径之比为5~15,样品体积可达柱床体积的20%~25%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用冷冻干燥发除去挥发性盐类。

(2)凝胶的类型

常用凝胶有葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表见附录6。

(3)凝胶的选择

根据所需凝胶体积,估计所需干胶的量。一般葡萄糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍,例如SephadexG-200的吸水量为20倍,1g SephadexG-200吸水后形成的凝胶体积约为40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好,但阻力大,流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100~200号筛目的SephadexG-200效果好;脱盐用SephadexG-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。

(4)凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒,使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸,这样可大大加速膨胀,通常在1~2h内即可完成。特别是在使用软胶时,自然膨胀需要24h 至数天,而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约

时间,而且还可消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

(5)样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的黏度不能太大,否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。

(6)防止微生物的污染

交联葡萄糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中十分重要,常用的抑菌剂有:①叠氨钠(NaN 3)在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易溶于水,在20℃使约为40%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因此叠氮钠不影响抗体活力;不会改变蛋白质和碳水化合物别的层析特性,但可影响荧光标记蛋白质。②可乐酮【Cl 3C-C (OH )(CH 3)2】在凝胶层析中使用量为0.01%~0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳,在强碱溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。③乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用量为0.05%~0.01%。在微酸性溶液中最有效。重金属离子可与含乙基汞代巯基的有机物质结合,因而包含乙基汞代巯基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。④苯基汞代盐在凝胶层析中使用量为0.001%~0.01%。在微碱性溶液中效果最佳,长时间放置可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀;还原剂可引起此化合物分解;含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

(7)凝胶回收

如果不再使用可将其回收,一般方法是将凝胶用水冲洗干净,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇含量达到90%以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。

5、聚丙烯酰胺电泳

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳简介

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体(monomer )丙烯酰胺(acrylamide ,简称Acr )和交联剂(crosslinker )N,N´-甲叉双丙烯酰胺(N,N´-methylenebisacrylamide ,简称Bis )在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺

凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE )

聚丙烯酰胺凝胶的优点很多,例如孔径大小与生物大分子具有相似的数量级,具有良好的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量,通过改变凝胶含量及交联剂度来调节凝胶的孔径,使大分子得到较好的分离。在一定含量范围内,凝胶透明,有弹性,机械性能好。基团带电,所以凝胶性能稳定,电渗作用小,无吸附,化学惰性强。与生物大分子不发生反应,电泳过程中不受温度、pH 的变化的影响。具有高分辨率和灵敏度,尤其是在不连续电泳系统中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体,样品不易扩散。并有多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度,分离蛋白质的灵敏度可达10-6g 。单体纯度高,在相同的实验条件下,电泳结果具有良好的重复性。凝胶杂质少,在很多溶剂中不溶,可适用于少量样品的制备,不致污染样品。

以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术,不仅能分离、小量制备生物大分子,而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。

①聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式

聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radical)的催化,使体系发生氧化还原反应(catalyst-redox systems )来完成的。催化体系主要有化学催化(AP-TEMED )和光化学催化(核黄素-TEMED )体系。

化学聚合(AP-TEMED 催化体系)(四甲基乙二胺TEMED )是一种脂肪族叔胺,它的碱基可催化溶液中AP 使其形成游离氧自由基。激活Acr 单体形成单体长链,同时在交联剂Bis 的作用下长链彼此交联聚合成凝胶。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP )以及加速剂TEMED ,四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基:

S 2O 82-+e-→SO42-+SO4-·

以R·代表自由基,M 代表丙烯酰胺单体,则聚合过程可以表示为:

R·+M→RM·

R·+M→RM·

RM·+M→RMM·

这样由于乙烯基“CH 2=CH —”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。

光聚合:催化剂是核黄素,核黄素在光照下能产生自由基,催化聚合反应。一般光照2~3h即可完成聚合反应。

②凝胶总含量及交联度与凝胶的性质

凝胶总含量及交联度:聚合后的丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、黏度和孔径大小均取决于两个重要参数凝胶总含量T 和交联度C ,T 是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分含量。C 是与T 有关的交联百分含量。T 与C 的计算公式是:

T=(a+b)/m×100%

C=b/(a+b)×100%

式中 a ——丙烯酰胺的质量,g ;

b ——甲叉双丙烯酰胺的质量,g ;

m ——水或缓冲液的体积,mL 。

式中a 与b 的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a 与b 的质量比应在30左右。选择T 和C 的经验公式是:

C=6.5—0.3T

当C 保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T 的增加而减小,当T 保持恒定,C 为4%时,有效孔径值最小,C 大于或小于4%时,有效孔径值均变大,C 大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C 是2.6%和3%。

凝胶总含量与凝胶的分子筛效应 凝胶的三维网状结构具有分子筛 效应,在凝胶中生物大分子的分离取决于它的净电荷和分子大小。分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小和生物大分子大小相接近的程度。凝胶含量不同,平均孔径也不同,不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力也不同,加上大分子的电荷效应,使各种大分子迁移率不同而得以分

离。

在实际工作中,常依据待分离蛋白质相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶含量,使蛋白质混合物得到最大限度的分离。大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果,所以这个含量的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时,常用标准胶或梯度凝胶来测试,而后确定适宜的凝胶含量。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的种类很多,有不连续凝胶电泳、制备凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(2)不连续凝胶电泳

PAGE 根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH 值及凝胶含量相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。

所谓不连续是指孔径大小、缓冲液成分、及其pH 均为不连续,并在电场中形成电位梯度的不连续性。①为样品胶,也可用蔗糖溶液或甘油代替;②为浓缩胶(又名成层胶或积层胶)以上两种胶的缓冲液、pH 值和孔径大小完全一致;③是分离胶(又名电泳胶)其孔径一般比浓缩胶小,pH 也不同。样品胶和浓缩胶T=3%、C=20%的单体溶液在Tris-HCl 缓冲液中,由核黄素催化合成大孔胶,其pH 为6.7。而分离胶是由T=7%、C=2.5%的单体溶液,在Tris-HCl 缓冲液(pH8.9)中,通过过硫酸铵催化聚合成的小孔胶。电泳槽内的缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液(pH 8.3)。

浓缩效应:样品在电泳开始时,通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般被浓缩几百倍),然后再被分离。当通电后,在样品胶和浓缩胶中,解离度最大的Cl -有效迁移率最大,被称为快离子,解离度次之的蛋白质则尾随其后,解离度最小的甘氨酸离子(pI=6.0)泳动速度最慢,被称为慢离子。由于快离子的迅速移动,在其后边形成了低离子浓度区域,即低电导区。电导与电势梯度成反比,因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面,由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,所以,也就聚集在这个移动的界面附近,逐渐被浓缩,在到达小孔径的分离胶时,已形成一薄层。

电荷效应:当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后,甘氨酸离子的

电泳迁移率很快超过蛋白质,高电势梯度也随之消失,在均一电势梯度和pH 的分离胶中,由于各种蛋白质的等电点不同,所带电荷量不同,在电场中所受引力亦不同,经过一定时间电泳,各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

分子筛效应:由于分离胶的孔径较小,分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时,所受阻滞的程度不同,因而迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时,受阻滞的程度不同,小分子走在前面,大分子走在后面,各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。

(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和鉴定蛋白质分子量。SDS-PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS 和β—巯基乙醇的样品处理液,SDS 即十二烷基磺酸钠【CH 3-(CH2) 10-CH 2OSO 3-Na +】,是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构,强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破环蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后,要在沸水浴中煮3~5min,使SDS 与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构。SDS 与蛋白质结合后使蛋白质-SDS 复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS 分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS 掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。

蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:

logMr=k—bX

式中:Mr 为相对分子质量;X 为迁移率,k 、b 均为常数,若将已知分质量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得

分子量。

6、亲和层析

亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如酶与底物的反应中,特异的底物(S )才能和一定的酶(E )结合,产生复合物(ES )一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在;后者进行反应时,底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L (对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M (如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L ,或者叫做固相载体;而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此,当把固相载体装入小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S 就可借助静电引力、范德华力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰。然后,恰当的改变起始缓冲液的pH 值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子,即可把物质S 从固相载体上解离下来,并形成了第M 个层析峰。显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意的分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后,可以重复利用。

上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体一般为简单的小分子物质(如金属、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。

7、聚焦层析

聚焦层析也是一种柱层析,因此,它和其他的层析技术一样,具有流动相,其流动相为多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂。聚焦层析原理可以

从pH 梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。

(1)pH 梯度溶液的形成

在离子交换层析中,pH 梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如,当使用阴离子交换剂进行层析时,制备pH 由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是,在梯度仪的混合室中装高pH 溶液而在另一室装低pH 极限溶液,然后打开层析柱的下端出口,让洗脱液连续不断的流过柱体。这时柱的上部到下部溶液的pH 值是由高到低变化的。而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,故pH 梯度溶液可自动形成。例如,当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时,先用起始缓冲液平衡到pH9,再用pH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体,这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加入,柱内每点的pH 值从高到低逐渐下降。照此处理一段时间,从层析柱顶部到底部就形成了pH6~9的梯度。聚焦层析柱中的pH 梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的,但是随着淋洗的进行,pH 梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的pH 却由pH9逐渐降至pH6,并最后恒定于此值,这时层析柱的pH 梯度也就消失了。

(2)蛋白质的行为

蛋白质所带电荷取决于它的等电点(pI )和层析柱中的pH 值。当柱中的pH 低于蛋白质的pI 时,蛋白质带正电荷,且不与阴离子交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的pH 值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH 高于其pI 时蛋白质由带正电荷变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境pH 再次低于pI 时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。

不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

(3)聚焦效应

蛋白质按其等电点在pH 梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH 梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH 梯度

的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动,它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH 处。从此位置开始,其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附,直到在等电点pH 时被洗出。若在此蛋白质样品被洗出前,再加入第二份同种蛋白质样品时,后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动,而不被固定相吸附,直到其迁移至近似本身等电点的环境处(即第一个作品的缓慢迁移处)。然后两份样品以同样的速度迁移,最后同时从柱底洗出。事实上,在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时,只要先加入者尚未洗出,并且具有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成,得到的结果也是满意的。

8、气相色谱

多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室汽化后呈气态。当载气流入时,气化的物质被带入色谱柱内,在固定相和流动相中不断地进行分配,在理想状态下,溶质于气-液两相间的分配可用分配系数描述。当分配系数小时,溶质在柱中就停留时间短,也即滞留因子大,所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器,经放大系统放大后,输出信号便在记录仪中自动记录下来,这时呈现的图形为色谱图,亦称色谱峰;当分配系数大时,溶质在柱中停留时间就长,其色谱图在记录仪上后出现。由于不同的物质有不同的分配系数,所以将一混合样品通过气-液色谱柱时,其所含组分就可得到分离。

气相色谱柱效率高、分辨率强的重要原因是,理论塔板数(N )大。毛细管气相色谱的N 可达105~106。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度(速率理论),就可明显提高柱效。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响。

(1)塔板理论

塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔,塔内存在许多块塔板,样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配,在柱内塔板间高度H (即理论塔板高度)一定时,在有效范围内,柱子越长,N 也就越大,样品各组分分配次数也就越多,分辨率自然提高;若柱长一定时塔板理论高度H 越小,就越能增加样品各组分的分配次数,进而提高其分辨率。

(2)速率理论

根据塔板理论,在H (塔板理论高度)一定时,增加柱长可以提高柱效。但是,柱子过长,将会延长分析时间,降低检测的灵敏度。所以实践中应设法降低H ,提高柱效。速率理论主要是分析同一样品的不同分子,在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。

9、高效液相色谱

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理类似。其不同之处是提高液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。

(二)溶菌酶

溶菌酶(lysozyme )是由Alexander Fleming 在1922年发现的有效的抗菌剂,因能选择性地溶解微生物细胞壁而得名。其全称为1,4-β-N-溶菌酶,又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G 。它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低渗溶液中细胞在内部渗透压的作用下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要裂解革兰阳性菌的细胞壁。革兰阴性细菌细胞壁黏肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构,故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。有些革兰阴性菌,如伤寒沙门菌、埃希大肠杆菌也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖,故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。

在实际应用中,由于它具有溶解细菌细胞壁的能力,起到抗菌消炎、消肿、镇痛、加快组织修复的作用,被广泛用于医疗行业;由于溶菌酶本身是一种无毒、无害、安全性很高的高盐基蛋白质,作为天然防腐剂的溶菌酶在食品工业中有广阔的应用价值;此外,还被用于饲料工业、用于提取微生物细胞内各类物质和进行原生质体制备及融合育种等科学研究领域。

溶菌酶具有以下特点:在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清内含量较高,鸡蛋中占蛋白总量的3.5%;它是碱性球蛋白,分子中碱性氨基酸、

酰胺残基及芳香族氨基酸比例很高;鸡蛋清中溶菌酶由129个氨基酸组成单一肽链,相对分子质量为1.43×10⁴,分子内有四对二硫键,分子呈一扁长椭球体;溶菌酶的活性中心为Asp52和Glu35;是一种罕见的稳定蛋白质,对温度和酸不敏感,在弱碱性条件下稳定,等电点为10.8。

鸡蛋清中含13%~15%的蛋白质,除了溶菌酶以外,还有其他的蛋白质,其主要特点分别见表9-1。

表9-1 鸡蛋清蛋白质组成

根据表9-1中溶菌酶与其他含量较高的蛋白质等电点的不同,以及溶菌酶本身的特点就可以应用等电点沉淀法除去大部分的杂质,从而得到溶菌酶的粗品。

1、溶解菌的来源

最初弗莱明发现人的眼泪、唾液及感冒后的鼻涕里含有溶菌酶。之后研究人员发现鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆,植物萝卜、木瓜、卷心菜等均含有溶菌酶。随着生物技术的发展,人类已经可以采用基因工程的办法来获得溶菌酶。

(1)天然资源的溶菌酶

在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中均发现有该酶存在。已知在人

的眼泪、鼻黏液、唾液、乳汁等分泌液中及肝、肾、淋巴组织中含有此酶。目前,从牛、马等的乳汁中已分离出了溶菌酶,其理化性质与人溶菌酶基本相似,但结构尚不清楚。

在植物资源方面,已从木瓜、芜菁、大麦、无花果和卷心菜等植物中分离出该酶。此种酶对溶壁小球菌活性较鸡蛋清溶菌酶低,但对胶体状甲壳质的分解活性则为鸡蛋清的10倍左右。

微生物也能产生溶菌酶,有7个类别:蛋白酶与内肽酶,酰胺酶,N-乙酰己糖胺酶,β-1,3、β-1,6-葡聚糖酶、甘露糖酶,壳聚糖酶,磷酸甘露糖酶,脱乙酰壳多糖酶。

鸡蛋清中的溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表,是溶菌酶群中重要研究对象,也是目前了解最清楚的溶菌酶。鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶。可分解溶壁小球菌、黄色八迭球菌和巨大芽孢杆菌等革兰阳性菌。从其他鸟类如鹤鹊、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中分离纯化出溶菌酶,与鸡蛋清之溶菌酶活性非常相似。

(2)人工资源的溶菌酶

从蛋清等自然资源提取溶菌酶易受生物材料来源限制,并且由于材料的不统一性,难以保证保鲜度、难以保证不受病毒和其他有害物质污染,产品质量不稳定,已有研究人员利用基因工程重组技术,借助大肠杆菌、酿酒酵母、霉菌等宿主系统,表达人溶菌酶基因,大规模地获得溶菌酶。

2、溶菌酶的理化性质

溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存而活性不丧失。其纯品为白色或微黄色结晶体或无定形粉末,无嗅,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚,其中鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子中含有4个二硫键,复性过程相对困难。Phillips 等人1965年用X 射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,揭示溶菌酶分子近椭圆形,大小为

4.5nm×3.0nm×3.0nm ,其构象复杂,α螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展的β片层结构。研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用。其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,为溶菌酶的活性部位。

3、溶菌酶的分离纯化

溶菌酶传统的分离纯化方法主要有结晶法、离子交换法、超滤法等,在近些年的研究中,也有学者将色谱技术、反胶团萃取技术、膨胀床吸附技术引入到溶菌酶的提取纯化工艺中。

(1)传统的分离纯化方法

①结晶法

结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法,通过改变溶液条件,使溶菌酶以结晶态析出。其产率一般为60%~80%,操作方法简单,应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产,使产品的成本大大降低,为其医药做出了贡献。但是其生产周期较长,产率相对偏低,高纯度产品获取过程复杂,另外此法不能用以分离微量的溶菌酶。

②离子交换法

离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术,由于具有简便、高效、成本低,且可自动化连续操作的优点,因此一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法。常用的离子交换剂有羧酸纤维素(PC )、羧甲基纤维素(CMC )和羧甲基琼脂糖等。

③超滤

超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品的高产出量,然而尽管超滤技术在反渗析及浓缩等过程中得到广泛的应用,但是它作为在生物工业领域中潜能很大的一种蛋白质分离技术仍然未被得到充分的利用。运用超滤技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品,如果在无菌条件下操作,可以直接生产无菌的溶菌酶溶液,直接用于临床治疗。

(2)分离纯化方法新进展

①色谱分离技术

色谱分离技术有多种类型,其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术,具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点,能满足生物大分子高效分离与纯化的要求,它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视,广泛地应用于大分子物质的纯化。在膜色谱中,又和亲和、离子交换等技术结合,衍生出亲和膜色谱技术、离子交换膜色

谱技术,均有研究者将其应用到溶菌酶的分离纯化中。

高速逆流色谱(HSCCC )技术是一种无固体载体的连续液-液分配色谱技术,其固定相通过重力场和离心力作用被保留在分离柱内,避免了固体载体与样品发生化学反应而不可逆吸附,样品回收率高。

20世纪80年代末出现了亲和色谱技术,以亲和力为基础的生物分离技术是将可逆结合的配基与不溶性的载体偶联,形成具有特异亲和性的分离介质,并用其来选择性的吸附生物活性物质,在通过洗脱来分离所需要的物质。

②反胶团萃取

反胶团萃取是近年发展起来的一种新的萃取方法,它是利用有机溶剂中加入少量表面活性剂形成的反胶团来提取的方法,为一些不能使用有机溶剂萃取的酶和活性蛋白质等生物活性物质开拓了一种新的分离技术,扩大了有机溶剂萃取的适用范围。

③膨胀床吸附法

膨胀床吸附技术能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品,集固液分离、吸附纯化为一体,是一个过程集成的操作,可以直接从含有细胞或细胞碎片等固体颗粒的高黏度料液中分离纯化目标产物。膨胀床吸附不仅克服了固定床吸附的缺点,而且缩短处理时间,简化步骤,提高了产品的产量和质量。Tong XD等报道使用被辛巴蓝3GA 修饰的一种定制的Nd-Fe-B 密实合金琼脂糖凝胶,扩张床吸附系统吸附、纯化溶菌酶的结果与使用CB 修饰的直线型凝胶相比较,具有更高的纯化倍数。Owen 等报道使用连续逆流、扩张床吸附系统分离溶菌酶,该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题,诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由上样溶液颗粒引起的柱阻塞等。

三、实验仪器

层析柱、砝码天平、分离收集器、核酸蛋白质检测仪、记录仪、分光

光度计、摇床、高速离心机、冰箱、电泳仪。

四、试剂与用品

1、试剂

SephadexG-50,0.02mol/L pH8.0的PBS 缓冲液,5%丙酮(PBS 缓冲液作为溶剂),鸡蛋,40%甘油,考马斯亮蓝试剂【考马斯亮蓝G-250 100mg 溶于50mL95%乙醇,加入100mL85%的H 3PO 4,用蒸馏水稀释至1000mL ,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(质量浓度)考马斯亮蓝G-250,4.7%(质量浓度)乙醇,8.5%(质量浓度)H 3PO 4】,标准蛋白质溶液【纯的牛血清白蛋白(BSA ),预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液】,样品S1、S2,0.5mol/LNaCl,枯草芽孢杆菌过夜培养物(37℃,18h ,160r/min,100/250mL),0.02mol/L pH8.0的PBS (测活缓冲液,含50mmol/L NaCl),0.02mol/L pH8.0的PBS (离子交换洗脱溶液,含0.5mol/LNaCl溶液),兔磷酸化酶B ,牛血清白蛋白,兔肌动蛋白,牛碳酸酐酶,胰蛋白酶抑制剂。

2、用品

试管及试管架,烧杯,漏斗,滤纸,垂直板电泳装置,移液管,移液枪,大针头,大培养皿,研钵,胶头滴管,玻璃棒,手术刀。

五、实验步骤

1、层析柱装填及柱效测定

(1)清洗层析柱。

(2)测定层析柱的内径、高度,计算所需凝胶的体积。 (3)根据SephadexG-50的膨胀体积,计算所需干凝胶的质量。 (4)称取相应质量的干凝胶,加入其总吸液量10倍的0.02mol/LPBS。 (5)在100℃水浴中加热溶胀1h 以上,溶胀之后将极细的小颗粒倾斜除去。

(6)用真空干燥器抽尽凝胶中空气,并将凝胶上面过多的溶液倾出。 (7)关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液。 (8)边搅拌,边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中,使其自然沉降。 (9)等凝胶沉降约2~3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉积。

(10)待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm 时停止装柱,关闭出水口。

(11)通过2~3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0,5~1mL/min)。 (12)始终保持凝胶上端有一段液体。

(13)准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白监测仪及记录仪。 (14)打开柱上端的螺丝帽塞子,吸出层析柱中多余液体直至与胶面向切。

(15)沿管壁将5%丙酮溶液0.6mL 小心加到凝胶床面上,应避免将床面凝胶冲起。

(16)打开下口夹子,使样品溶液流入柱内,同时收集流出液,当样品溶液流至与胶面向切时,夹紧下口夹子。

(17)按加样操作,用1mL 洗脱液冲洗管壁2次。 (18)加入3~4mL洗脱液于凝胶上旋紧上口螺丝帽。

将层析柱进液口连通恒流泵,柱出液口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连,比色池出液口再与自动部分收集器相连,用两根导线将检测仪与记录仪连接起来,设置好基线的位置。

洗脱时,打开上、下进出口夹子,用0.02mol/LpH8.0的PBS ,以0.5~1mL/min流速洗脱,记录tr (记录仪纸速设为12cm/h,电压200mV ;核酸蛋白监测仪检测波长254nm ,灵敏度0.1A ),计算单位高度的柱效。柱

效计算公式:

N=5.54·【θr/(W 1/2)】2

式中,θγ为平均洗脱时间是tr 的平均值,;W 1/2为半峰宽测量时精确到1mm 。SphadexG-100每米理论塔板数为3000~6000。

注意:

①各接头不能漏气,连接用的小乳胶管不要有破损,否则造成漏气、漏液。 ②装柱要均匀,既不过松,也不过紧,最好在要求的操作压下装柱,流速不宜过快,避免因此压紧凝胶。

③始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分蒸发,凝胶变干。也要防止液体流干,使凝胶混入大量气泡,影响液体在柱内的流动。

④所用凝胶比较昂贵,需小心操作,实验后回收,尽量避免浪费和损失。

⑤如实完整地记录实验流程、现象及结果,计算理论塔板数并对其进行深入分析和讨论。

⑥结合理论塔板模型,分析注销的影响因素,以及如何提高柱效。

2、等电点沉淀法粗提取溶菌酶

(1)拿一只鸡蛋破壳取蛋清置于250mL 烧杯中,记录其体积V1. (2)加入1.5倍体积的pH8.0 PBS缓冲液,搅拌均匀,取0.5mL 蛋清并

加入等量甘油于1mL 离心管中,制备2管,—20℃备用(样品S1)。

(3)用冰醋酸调pH4.7左右,充分搅拌。 (4)3500r/min,离心20min 。 (5)弃沉淀,转移上清至烧杯中。

(6)加入1倍体积的pH8.0 PBS缓冲液,搅拌均匀,并用5mol/L NaOH调pH8.0;

(7)滤纸过滤,取清液,测量并记录体积V2.

(8)取0.5mL 清液并加入等量甘油于1mL 离心管中,制备2管,—20℃备用(样品S2)。

(9)余下的清液放在100mL 烧杯中—20℃冻存备用。

注意:

①等电点沉淀后,利用离心的办法,要尽量除去沉淀。 ②调节pH 时要避免局部过酸。 ③提取过程中尽量避免泡沫的产生。

④保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期,最好使用标签纸。

3、考马斯亮蓝G-250制作蛋白质标准曲线

按照Bradford 的测定方法。先绘制标准曲线:取6支具塞试管,按表9-2加入试剂(0~100μg/mL的标准蛋白)。

表9-2 绘制蛋白质标准曲线的溶液及其用量

标准蛋白

管号

质/ml

1 2 3

0.00 0.20 0.40

/ml 1.00 0.80 0.60

/μg 0 20 40

4 5 6

蒸馏水

蛋白质含量

管号

/ml 0.60 0.80 1.00

/ml 0.40 0.20 0.00

μg

标准蛋白质蒸馏水标准蛋白质/

60 80 100

混合均匀后,向各管中加入5mL 考马斯亮蓝G-250溶液摇匀。并放置5min 左右。在595nm 下比色测定吸光值。

(1)以A 595nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为0μg、 20μg、40μg、60μg、80μg、100μg),在坐标轴上绘制标准曲线。

(2)利用标准曲线查出回归方程。

(3)用Excel 作图,测出回归线性方程。即A 595nm =a×X 。相关系数一般大于0.9。

(4)未知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上,取合适体积的未知样品,使其测定值在标准曲线的直线范围内(0~100μg,最好在40~80μg),根据所测定的A 595nm ,利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量(μg),从而计算出未知样品蛋白质的浓度(mg/mL)。

一般被测样品的A 595nm 值在0.1~0.5,所以上述样品如果A 595nm 值太大,可以减少取样量,如果仍然很大,可以定量稀释后再进行测定。

注意:

①蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速,在2min 左右反应达到平衡;其结合物在室温下1h 内基本稳定。如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。

②测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

③有些阳离子,如K 、Na 、Mg 、(NH 4)2SO 4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。

④测定时仅使用一套比色杯(2个),并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯,仅用待测液润洗2~3次即可。

⑤玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥,避免温度变化;取量要准确。

+

+

2+

4、离子交换层析法分离纯化溶菌酶

(1)装柱:取20mL CM-Sepharose FF,1.0cm×20cm 层析柱,以0.02mol/L PBS ,pH8.0为缓冲液装柱。装柱方式与装填分子筛层析柱的方法一样。注意不能使树脂露出水面,因为树脂露于空气中,当加入溶液时,树脂间隙会产生气泡,而使交换不完全。对于重复使用的填料,需要先冲3倍柱床体积蒸馏水,将保存用的乙醇洗脱出来。

(2)平衡:用泵将3倍柱床体积的0.02mol/L PBSpH8.0过柱。这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一,以利后续目的蛋白的结合。

(3)上样:用泵将S2样品泵入层析柱,经过一段时间之后,蛋白将通过离子交换的方式,与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录280nm 下吸收值的变化。

(4)冲平:用3~4mL0.02mol/LpH8.0的PBS 洗涤离子交换柱至无穿透峰为止,流速约1.5mL/min。(在吸收峰下降段留样S3,取约1mL 于离心管中—20℃冻存备用)。

(5)洗脱:用100mL 含0.5mol/L NaCl 的0.02mol/L pH8.0的PBS 和

100mL 0.02mol/L pH8.0的PBS 进行梯度洗脱。

收集洗脱峰,记录洗脱时间和洗脱峰体积V 4。取0.5mL 清液并加入等量40%甘油于1mL 离心管中,制备2管,—20℃备用(留样S 4)。 (6)再生:用泵将2倍柱体积的2mol/L NaCl 过柱,然后水洗4

倍柱体积。洗脱完成后,需要进行离子交换填料的再生处理。离子交换基团为一些盐所覆盖,影响下次的重复使用。因此,先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来,然后再恢复其离子交换功能。对于CM-Sepharose 而言,只需要用水过柱即可以使其离子交换功能得以恢复。

(7)保存:用泵将2倍柱体积的20%乙醇过柱。介质回收于蛋白

质分离纯化的介质多保存于液体中。保存时需加入一些抑菌剂,如叠氮化钠等。对于本介质,只需采用20%乙醇保存即可。

对于洗脱下来的样品,我们无法确定是否含有溶菌酶,因此需要进

行监测,一般采取活性监测的方式。本实验中利用溶菌酶水解枯草芽孢杆菌细胞壁,使得枯草芽孢杆菌裂解,以595nm 下光吸收值的变化来确定溶菌酶所在的吸收峰。

(8)溶菌酶的活性测定:取6mL 枯草芽孢杆菌的过夜培养液, 3500r/min常温离心5min ,弃上清,沉淀用6mL0.02mol/LPBS缓冲液悬浮, 利用可见光分光光度计测其OD595并记录(吸光度在0.5~1.0范围,如果 读数过高可以适当稀释)(表9-3)。

表9-3 比色皿编号及反应体系

其中1只加入PBS 作为仪器调零空白,2作为对照,3、4用于平行测定然后取平均值,30s 测定一次吸光度值,约30min 内至吸光度达到稳定,

在室温,以1号管为对照,每隔30s 分别测定2、3、4在595nm 的吸光度。(因仪器数量有限,请各组错开时间进行,确保仪器准备完毕才加入酶液。

观察悬液OD 595反应前后的变化。根据以下酶活定义,测定溶菌酶S 1~S 4活性。其中活力单位(U ):酶在室温(25℃),pH8.0条件下,OD 650每分钟降低0.001为1个活力单位。

注意:

①离子交换树脂再使用前需要再生,阴离子交换树脂以“碱酸碱”的顺序进行处理,阳离子交换树脂以“酸碱酸”的顺序进行处理和再生。装柱时要求粒度均匀,比较致密,柱床表面平整,柱中无裂缝,气泡和沟流的现象。

②加样蛋白浓度低于20mg/mL,上样体积小于柱体积的1/3。

③在整个实验过程中,流速必须得到一定的控制。过大,会使填料压缩紧密,导致流速过低,引起酶的活性变化。对于CM Sepharose FF填料,最适流速在100cm/h以下。因此,在我们的实验中,控制流速为2mL/min。

④冲平过程一定不能省略。因为在上样过程中,还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出,因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平,以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出,以免干扰洗脱。

如实完整地记录实验流程、现象及结果;分析记录仪上所绘制的峰型与所分离的蛋白质纯度的关系。

实验报告中必须包含原始数据以及洗脱曲线图

本实验的数据处理:根据酶的动力学特性可知,在特定的时间段,酶促反应的速度是相等的,即产物浓度随时间呈线性变化。根据此特性,将所得数据在坐标纸上作图,以时间为横轴,OD 595值为纵轴,将数据定位后,根据拟合直线的斜率,即为单位时间内OD 值的下降值,然后再除以0.001,即可得到所取酶液的活力单位。除以酶液体积,即可得到酶浓度(U/mL)。

5、SDS-PACE 法测定溶菌酶分子量 (1)实验试剂配制 ①低分子量标准蛋白:

兔磷酸化酶B Mr=97400 牛血清白蛋白 Mr=66200 兔肌动蛋白 Mr=43000

牛碳酸酐酶 Mr=31000 胰蛋白酶抑制剂 Mr=20100

开封后溶于200μL蒸馏水,置—20℃保存,使用前室温融化,沸水浴中加热3~5min后上样。

②待测蛋白质样品:S 1~S4。

③凝胶储液:称Acr30g ,甲叉双丙烯酰胺(Bis )0.8g ,加蒸馏水至100mL ,过滤后置棕色瓶中,4℃储存可用1~2月。

④分离胶缓冲液(1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液):称取Tris45.5g 加入200mL 水,用6mol/L的盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至250mL 。

⑤浓缩胶缓冲液(1.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液):称取Tris18.2g 加入50mL 水,用1mol/L的盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100mL 。

⑥10%(质量浓度)SDS 10mL。

⑦10%过硫酸铵(AP ) 10Ml (使用当天配制)。 ⑧TEMED (四甲基乙二胺)。

⑨样品稀释液:SDS (500mg )+巯基乙醇(1mL )+溴酚蓝(4mg )+甘油(3mL )+1.5mol/L pH6.8 Tris-HCl(2mL ),最后定容至10mL 。

⑩固定液:取500mL 乙醇,100mL 冰乙酸用蒸馏水定容至1000mL 。 ⑪. 脱色液:乙醇250mL ,冰乙酸80mL ,加蒸馏水定容至1000mL 。 ⑫. 染色液:称取考马斯亮蓝G-250 1.0g,用少量脱色液溶解定容到 1000mL 。

⑬. 电极缓冲液(pH8.3):称Tris 30.3g,甘氨酸144.2g 加入SDS 10g (稀释前加),加蒸馏水使其溶解后定容至1000Ml, 使用时稀释10倍。

⑭. 1.5%琼脂糖200mL 。 (2)蛋白样品的制备

取200μL上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中,加入200μL的2×上样缓冲液,混匀,轻轻盖上盖子,封口膜封紧瓶口以免加热时迸出,在100℃沸水浴中加热3~5min,取出后10000r/min离心10min ,取上清待用。(3)凝胶制备

①将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。

②把玻璃板在灌胶支架上固定好,勿用手接触洗净的玻璃表面。

③琼脂糖封长板下口空隙,要避免产生气泡。 ④按表9-4比例配好分离胶。 表9-4 分离胶和浓缩胶的配比

用移液管快速加入,大约5cm 左右,(距样品梳下缘大约1cm ),之后加少许蒸馏水,静置40min 。 (4)加样

拔出样梳,用滤纸吸去槽中多余液体,用针头对加样孔进行校正,然后用移液枪进行加样,在中间孔中加入标准蛋白质20μL,两侧孔中加入待测蛋白20μL,最后在上储槽内加入电极缓冲液(内含0.1%SDS)沒过短板。 (5)电泳

电泳槽下槽中加入缓冲液(内含0.1%SDS),接通电源,进行电泳,开始时电流恒定在10mA 或恒压80V ,当进入分离胶后改为20mA 或120V ,待溴酚蓝距凝胶边缘约1cm 时,停止电泳。 (6)剥胶

电泳结束后,用手术刀撬开玻璃板,用蒸馏水处理剥至含蒸馏水的培养皿中。 (7)固定

把剥下来的胶用蒸馏水清洗2~3次,假如固定液,固定1~2h至凝胶变白。 (8)染色

用蒸馏水清洗固定后的胶2~3次,加染色液染色1h 。 (9)脱色

染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到脱去背景色。 (10)分析计算

按下式计算相对迁移率:

相对迁移率=蛋白质迁移的距离(cm )/溴酚蓝迁移的距离(cm )

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线,量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量,这样的标准曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

注意:

①N,N ´-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质,可经皮肤直接吸收,使用时应避免其直接接触皮肤,必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。

②安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝,避免缓冲液渗漏。 ③用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡,以免电泳时影响电流的通过。 ④加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡,如有气泡,可用注射器针头挑除。

⑤固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板。 ⑥凝胶配制过程要迅速,注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。

六、思考题

1.生物活性物质的粗提取有哪些方法?如何进行选择?

2.本实验可否采取其他的粗提取方法?

3.以粗分离中的离心和膜分离为例,说明其主要原理并举例。

4.在等电点沉淀中,为何pH4.7不能使蛋白质变性沉淀?

5.在等电点沉淀中,为何要先调pH4.7左右,又需要将pH 调回8.0?

6.为何制作蛋白质标准曲线?

7.酶活的一般定义?在提取过程,为何要测定蛋白质浓度?

8.离子交换树脂填料如何再生?使用时有哪些注意事项?

9.在层析中为何要使用冲平这一步骤?

10.为何要在整个分离纯化过程中,不断的监控酶的活性?

11.分光光度测定溶菌酶的活力的原理是什么?注意事项有哪些?

12.在不连续体系SDS-PAGE 中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?

13.电极缓冲液中甘氨酸的作用?

14.在不连续体系SDS-PAGE 中,分离胶和浓缩胶中均含有TEMED 和AP ,试述其作用?

15.样品液为何在上样前需在沸水中加热几分钟?


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