水蛭中水蛭素含量测定的改进

第33卷第19期

2008年10月

　　　　　　　　　　　　　　　　

　October,

ChinaJournalofChineseMateriaMedica

　　　中国中药杂志

Vol.33,Issue　19

2008

水蛭中水蛭素含量测定的改进

范尚坦,李金兰,张　勇,赖丽萍

(南京军区福州总医院,福建福州350025)

3

　　水蛭素活性测定方法目前主要有以chromonymTH为生色底物的比色法、光散射法和凝血酶滴定

015g(人)纤维蛋白原溶解,即得含015%(人)纤维

蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。2.1.3　凝血酶滴定液的配制　将100NIH・mL

-1

法。2005年版《中国药典》收载了用凝血酶滴定法

[1]

测定水蛭药材中的水蛭素,其原理是水蛭素可与凝血酶以1∶1比例结合,而凝血酶已有标准的国际单位NIH,因此可以用抗凝血酶活力单位ATU来表示水蛭素的活性,即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。在对宽体金线蛭和柳叶蚂蟥中水蛭素含量进行测定时发现药典方法存在一定缺陷。现将用药典法测定水蛭素时碰到的问题及对药典法进行改进的结果报道如下。

1　仪器与试药

(人)纤维蛋白原(基甲烷(050914);凝血

的凝血酶加入215mL的019%氯化钠溶液,配成浓度为40NIH・mL的凝血酶滴定液。

2.1.4　水蛭素的含量测定　精密量取提取液各100μL,置试管(10mm×100mm)中,加入含0.5%(人)纤维蛋白原200μ,置水浴(37±015)

-1℃5μL・min,边滴加)。

-1

U=C1V1/(C2V2W)

-1

U为每1g含凝血酶活性单位(U・g);C1为凝-1

血酶溶液的浓度(U・mL);C2为供试品溶液的质量-1

浓度(g・mL);V1为消耗凝血酶溶液的体积(μL);

μL);W为取样量。V2为供试品溶液的加入量(

酶(黑龙江迪龙;(宽体金线蛭)(产地

湖北)、柳叶蚂蟥均购于省药材公司(产地河南),南京军区福州总医院主任药师范尚坦鉴定。

TGH-16C离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);DFY-500型50克摇摆式高速中药粉碎机(浙江温岭市大海药材

结果表明按照药典方法测定,水蛭提取液滴加纤维蛋白原溶液后,即出现纤维蛋白原絮状沉淀,以致滴加凝血酶后,本应出现溶液凝固的现象不再出现。显然,水蛭提取液中一定有某些物质或某种因素促使纤维蛋白原变性析出。经过反复探索,发现导致纤维蛋白原变性析出的原因是水蛭提取液的酸性太强(宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的提取液pH均在3左右)。为此,作者对药典法测定水蛭素的方法做了一些改进。

2.2　含量测定方法改进

2.2.1　提取液pH对含量测定结果的影响　取宽

器械厂);PHS-3C型精密pH计(上海精密科学仪

器有限公司);超声波清洗仪(上海跃进医用光学器械厂)。2　方法与结果2.1　药典法测定含量

2.1.1　提取液的制备　精密称取宽体金线蛭和柳

叶蚂蟥粉末各约1g,精密加入0.9%氯化钠溶液5mL,充分搅拌,浸提30min,并时时振摇,5000r・min离心15min,分离上清液备用。

2.1.2　缓冲液的配制　取012mol・L三羟甲基

-1

-1

体金线水蛭和柳叶蚂蟥(070108)提取液各11份,每份1mL,用110mol・L

-1

NaOH分别调节其pH

氨基甲烷溶液25mL与011mol・L盐酸溶液40mL,加水至100mL,用pH计调节其pH至714,加入

[收稿日期]　2008202226

[通讯作者]　3范尚坦,Tel:(0591)22859466,[1**********],E2mail:[email protected]

-1

至110,210,310,410,510,610,710,810,910,1010,

1110,按药典方法进行测定(表1)。

　　结果表明宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的提取液在pH至4～7时凝血酶滴定法测定为阳性结果。在pH510时,抗凝活性均较高。当pH310以下,由于

酸性太强,纤维蛋白原均析出沉淀,再滴加凝血酶,

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品种宽体金线蛭

　　　　　　　　　　柳叶蚂蟥　

　　　　　　　

/U---[1**********]0---[1**********]0

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药典方法(不同pH)测定2种水蛭含量　　表1　

品种宽体金线蛭

　　　　　　　　　　柳叶蚂蟥　

　　　　　　　　　　

pH[***********][***********][***********][**************]0

表2　提取液最佳pH考察

pH[***********][***********][***********]516518610

提取液+纤维蛋白原现象浑浊,絮状物

浑浊,絮状物浑浊,絮状物澄清澄清澄清澄清微浑成乳状成乳状成乳状

浑浊,絮状物浑浊,絮状物浑浊,絮状物澄清澄清澄清澄清微浑成乳状成乳状凝血酶用量抗凝活性

/μL---5251081000---8201251000

凝血酶用量/μL

[***********][**************]10

抗凝活性/U

[***********][***********]36302420

　　注:表中“-”始终无法凝固。pH81,水蛭素活性消失,一加凝血酶,提取液立即凝固成胶冻状,不显抗凝活性。

2.2.2　提取液最佳pH确定　调节提取液pH410,412,414,416,418,510,512,514,516,518,610,按药

　　注:表中“-”表示无限量;提取液+纤维蛋白原现象均为澄清

表3　改进方法验证结果

品种　　　　宽体金线蛭

　　　　　　　　柳叶蚂蟥　

　　　　

No1

编号

[***********]

凝血酶用量/μL水蛭素/U

[***********][***********]

[***********][***********]

　

070108

典方法测定水蛭素含量(表2)。

结果表明宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的抗凝活性,在pH510时均达最高值;pH高于或低于510均呈逐渐下降趋势。故pH510为二者的最佳pH。2.2.3　含量测定改进方法的验证　将二者提取液pH均调到510,按药典方法测定水蛭素含量(表3)。

　　

070125

　　

070210

　　

070108

结果表明通过pH调节后,可准确测定出宽体金线蛭和柳叶蚂蟥中水蛭素的含量。改进方法有效可行。3　讨论

　　

070125

凝血酶滴定法测定水蛭中的水蛭素首次以药典方式收载于2005年版药典。结果表明:用凝血酶滴定法测定水蛭中的水蛭素,提取液的pH对测定结果产生非常大的影响,当pH310以下,由于酸性太强,纤维蛋白原析出沉淀,再滴加凝血酶始终无法凝・

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070210

　

　　注:提取液+纤维蛋白原现象均为澄清

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固;pH810以上时,水蛭素活性消失,加凝血酶,提

取液立即凝固成胶冻状,不显抗凝活性;当pH510时,抗凝活性最高测定结果最为准确。pH高于或低于510时,其抗凝活性均呈逐渐下降趋势。而药典法水蛭的提取液pH在3左右,由于酸性太强,导致纤维蛋白原析出,测定无法进行。

-1

　　有文献报道,在011mol・LHCl或011mol・。实验结果证明,当溶液的pH810以上时,水蛭即失去抗凝活性;当pH低于410时,可导致纤维蛋白原变性,用凝血酶滴定法无法证明其有抗凝活性,也无法进行水蛭素含量测定。L

NaOH中水蛭素可稳定15min

-1

[2]

在37℃以上,凝血酶会变性或部分丧失活力,从而得不到结果。所以必须在恒温水浴锅中反应。②纤维蛋白溶液的浓度对含量测定有影响,本实验含量测定所用纤维蛋白原浓度为015%,当浓度偏高时,则测定结果含量偏低,当浓度偏低时,则可能导致含量过高或者始终无法凝固。③测定时用的纤维蛋白原缓冲溶液及凝血酶均应现配现用,因为纤维蛋白原及凝血酶配成溶液后,容易变性从而影响药效。在配制纤维蛋白原时应先使温度升高到30～37℃,然后进行溶解。温度过低往往会造成溶解困难并导致蛋白变性。[参考文献]

[1]　中国药典.一部[S].2005:57.

[2]　HofmanA,HoffmannA,MarknardtF1Inhibitionofthethrombin2

plateletreactionbyhirudin[J1984,14(2):164.

实验过程中采用凝血酶滴定法测定水蛭素含量

时,有三点需特别注意:①其测定结果易受到环境温度和凝血酶活力的影响。在操作过程中,温度应控制在25～37℃,因为20℃以下测定结果会偏高,而

[责任编辑　鲍　雷]

(上接第2270页)

[11]　朱　肱.类证活人书[M:,[12]　庞安时.:,1956.

[13]　郎　瑛.七修类稿[M//1四库全书.上海:上海古籍

[]　伊广谦.中医方剂名著集成[M].北京:华夏出版社,1998:

85.

[16]　陈元靓.事林广记[M].元至顺刊本.

[17]　唐慎微.证类本草[M].北京:华夏出版社,1993:605.[18]　洪　遵.洪氏集验方[M].上海:上海科学技术出版社,

2003:6.

出版社,1987:102.4.

[14]　吴　恕.伤寒图歌活人指掌[M].明末致和堂刻本.

StudyonmeasuringunitsofChinesemedicineinSongdynasties

ZHANGRui2xian,LUQin,ZHANGWei,ZHANGMu2qun

1

2

1

1

(1.ChinaInstituteofChineseMaterialMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;

2.JiangxiuniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China)

[Abstract]Theoriginalchangesoftheweightmeasuringunit

ofmedicineintheSongdynastieswastheappearanceofDengzi(smallsteelyardforweighingmoney).The"largerscale"and"smallerscale"wereunified.Themeasuringunit"qian"waswidelyused,andfurthermore"Cheng"and"zi"wereusedasmeasuringunitsrelatedtomedicine.

[Keywords]　Songdynasties;measuringunitsofChinesemedicine;weightsandmeasures

[责任编辑　吕冬梅]

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