硝普钠对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体功能的影响

植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2006, 32 (2): 239-244239

硝普钠对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体功能的影响

何虎翼，何龙飞*，黎晓峰，顾明华

广西大学农学院，南宁530005

摘要：硝普钠(SNP)能够缓解铝对黑麦和小麦根伸长生长的抑制效应。铝降低黑麦和小麦的呼吸速率和P/O、OPR、R+3、R4、RCR值以及线粒体膜H+-ATP酶、H-PP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性，而SNP则能提高铝胁迫下呼吸速率、P/O、OPR、R3、R4、RCR值和这些酶活性。说明铝胁迫导致黑麦和小麦根尖细胞线粒体呼吸功能受损，氧化磷酸化解耦联。黑麦受损程度较小麦低，具有较强耐铝能力。SNP作为一氧化氮(NO)的供体，推测NO可以有效减轻铝胁迫导致的小麦根尖线粒体呼吸功能障碍，从而能够缓解铝毒害。关键词：铝胁迫；硝普钠；黑麦；小麦；线粒体；呼吸功能

中图分类号：Q945

在我国的15个省区都有酸性土壤分布，约占全国土地总面积的21%。铝毒害是这些地区限制植物生长的主要因素(应小芳等2003)，因此提高植物的耐铝性是植物抗逆研究的重要课题。铝对植物的主要毒害症状为根的伸长生长受到抑制和根尖结构受到破坏。黑麦耐铝性强(Li等2000)，研究黑麦的耐性机制对于阐明植物耐铝机理，改良作物，提高作物产量有重要意义。

目前对黑麦耐铝性机理研究主要集中在有机酸分泌。根尖线粒体除了产生足够的能量物质外，也是内环境紊乱时氧自由基产生的主要场所。Yamamoto等(2002)认为铝胁迫可以引起豌豆和烟草细胞线粒体电子传递中泄露的电子增加，活性氧的爆发导致细胞内氧化损伤从而抑制根伸长生长。一氧化氮(NO)是植物体内最新发现的生物活性小分子，大量的研究结果表明NO是一全能分子(do it allmolecule)，在植物生活史中起重要作用(Delledonne2005)，能够提高植物对生物和非生物胁迫的耐受能力，例如抗病、耐干旱、盐胁迫、紫外线B照射和细胞程序性死亡，在植物体内它主要由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS, EC I.14.13.39)和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR, EC 1.6.6.1/2)催化合成。

NO可以减轻小麦脂质过氧化损伤、保护质膜和液泡膜ATP酶，对缓解盐胁迫有一定的效果(Ruan等2004)，但是NO对铝胁迫的作用未见报告。硝普钠(sodium nitroprusside)是NO的供体。本实验研究了

SNP对铝胁迫下黑麦根尖线粒体结合酶活性和呼吸功能的影响，为进一步阐明NO对铝胁迫下植物耐铝性调节分子机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1　供试材料

耐铝黑麦品种(Secale cereale L. cv. King)的种子购自日本大阪Taki种子公司。对铝敏感的小麦品种(Triticum aestivum L. cv. Jinmai47)由广西大学农学院农业资源与环境实验室提供。1.2　幼苗培养及处理方式

将供试的黑麦King和晋麦47种子经1%次氯酸钠溶液消毒，用水洗净后，以水浸泡过夜。浸泡后的种子播于塑料网上，塑料网置于盛0.5 mmol/L的氯化钙溶液(pH 4.5)的塑料盘中。将催芽4 d的幼苗移栽到略为改动的1/5Hoagland完全营养液中培养，每2 d更换一次营养液，每天调pH值至4.5，并不断向营养液中充气。营养液成分(浓度单位为mmol/L)为：Ca(NO3)2·4H2O(0.8)，KNO3(1)，MgSO4·7H2O (0.4)，NH4H2PO4 (0.2)，Fe-EDTA (2.0×10-2)，H3BO4 (2.3×10-2)，MnCl2·4H2O (5.0×10-4)，CuSO4·5H2O (2.0×10-4)，(NH4)6Mo7O24·4H2O (1.0×10-3)。当幼苗长至两叶一心期时进行处理，处理方式如下：Ca组(CaCl2 0.5 mmol/L溶液); Ca+Al组(含AlCl3 50 µmol/L的0.5 mmol/L CaCl2溶液);Ca+Al+SNP组(含AlCl3 50 µmol/L及SNP 1 mmol/L的0.5 mmol/L CaCl2溶液); Ca+SNP组(含SNP 1 mmol/

2005-07-18收到，2006-01-17接受。

国家自然科学基金项目(Nos. 30360048, 30560070)资助。

*通讯作者(E-mail: [email protected]; Tel: 0771-3237917)。

240 植物生理与分子生物学学报 32卷

L的0.5 mmol/L CaCl2溶液)。溶液pH4.5。处理24h后，切取小于1 cm的根尖进行生理生化分析。实验独立重复3次。

1.3　铝处理下黑麦幼苗根伸长生长量

黑麦幼苗抽出第一片真叶后，选取根长为3.5~4 cm的幼苗以含有0.5 mmol/L的CaCl2溶液处理，处理方式同1.2，处理前及处理24 h后分别量根系的长度，处理前后根长的差值即为根的伸长量，从而计算根的相对伸长率。1.4　酶活性测定

根尖线粒体提取参照王金胜(1999)的方法，测定时线粒体用量以线粒体蛋白(mg)表示。蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法。Na+-K+-ATP酶活性测定参照上海植物生理学会(1985)方法。Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性测定按照李杨瑞(1987)的方法。H+-ATP酶水解活性测定依照章文华等(2002)的方法，酶活性用ATP酶解产生的无机磷计算，无机磷的测定按照Ohnishi (1975)等的方法。H+-焦磷酸酶的水解活性测定除了用焦磷酸钠0.3 mmol/L代替ATP二钠盐3 mmol/L外，其余步骤与H＋-ATP酶水解活性测定相同，Pi标准曲线的制备利用KH2PO4做标准品。

1.5　呼吸功能测定

参照Chavez等(1995)的方法。

铝胁迫组相比，加入1 mmol/L SNP可以降低铝对黑麦根伸长抑制率5.4%，对小麦的效果尤为显著，达14.7%；单独使用SNP也极显著促进根的伸长生长(表1)。这可能是SNP作为NO供体，产生NO，而NO通过质外体直接作用于细胞壁组分，导致细胞壁松弛，从而促进细胞扩展(Leshem和Haramaty1996)，或增加胞内保护蛋白，降低铝引起的氧化胁迫的结果(Wendehenne等2004)。

2.2　SNP对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体H+-ATP酶和焦磷酸酶(H+-PP酶)水解活性的影响

线粒体H+-ATP酶是膜固有的一种蛋白脂质复合体，其水解功能是通过水解ATP释放能量，进行逆浓度梯度的离子转运，从而保持细胞内外离子浓度的相对稳定，以维持生物体正常的生理代谢(何龙飞等2001)。图1表明，对于黑麦来说，铝胁迫显著降低H+-ATP酶活性，加入SNP可以提高其活性，在小麦中更明显。

2　结果

2.1　SNP对铝胁迫下黑麦和小麦根伸长生长的影响在50 µmol/L的铝胁迫下，黑麦根伸长抑制率约为41.8%，小麦根伸长抑制率约为83.6%，均与对照差异极显著，黑麦耐铝能力显著高于小麦。与

表1　SNP对黑麦和小麦根伸长生长的影响

Table 1　Effects of SNP on root elongation of rye and wheat

图1　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体H+-ATP酶活性的影响Fig.1　Effects of SNP on mitochondrial H+-ATPase activity of ryeand wheat root tip

何龙飞等(2001)认为线粒体膜H+-PP酶具有水解酶活性，通过水解焦磷酸为合成ATP提供所需的无

Rye King Wheat Jinmai47

Treatment Relative Relative Relative Relative

elongation (cm) elongation rate (%) elongation (cm) elongation rate (%)

CaCa+AlCa+Al+SNPCa+SNP

3.72±0.12 B2.17±0.12 C2.37±0.16 C4.26±0.18 A

100 58.2 63.6114.5

1.41±0.09 B0.23±0.02 D0.44±0.03 C2.46±0.07 A

100 16.4 31.1175.1

Different capitalized letters and minuscule letters mean significance at 0.01 and 0.05 level, respectively. The same as below.

2期何虎翼等: 硝普钠对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体功能的影响 241

机磷。铝胁迫下，黑麦和小麦H+-PP酶活性显著下降，小麦下降幅度更大。加入SNP后，H+-PP酶活性增加(图2)，但小麦H+-PP酶增加不显著。

图2　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体H+-PP酶活性的影响Fig.2　Effects of SNP on mitochondrial H+-PPase activity of ryeand wheat root tip

2.3　SNP对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体Na+-K+-ATP酶活性的影响

线粒体膜Na+-K+-ATP酶的主要作用是分解ATP，逆浓度差把胞外的K+移入胞内，同时把胞内的Na+转运到胞外，从而维持胞内高K+、胞外高Na+的跨膜离子浓度梯度，一旦膜上的离子通道开放，Na+、K+会迅速顺浓度差跨膜扩散，这种跨膜的电化学梯度是信号传导和细胞兴奋的基础(黄仲荪和曾昭淳2000)。图3表明，铝胁迫显著降低黑麦和小麦根尖线粒体Na+-K+-ATP酶活性，小麦下降幅度更大，加入SNP则显著提高铝胁迫下的Na+-K+-ATP酶活性。

图3　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体Na+-K+

-ATP酶活性的影响Fig.3　Effects of SNP on mitochondrial Na+-K+-ATPase activity ofrye and wheat root tip

2.4　SNP对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性的影响

Ca2+-ATP酶通过主动转运Ca2+，使胞浆内游离Ca2+处于较低水平，如其活性下降，则会导致胞内

出现Ca2+超载现象。铝胁迫显著降低黑麦和小麦根尖线粒体Ca2+-ATP酶活性，在黑麦中下降幅度更大，加入SNP显著提高Ca2+-ATP酶活性(图4)。

图4　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体Ca2+-ATP酶活性的影响Fig.4　Effects of SNP on mitochondrial Ca2+-ATPase activity ofrye and wheat root tip

Mg2+-ATP酶主要是调节跨膜离子流及维持膜上功能蛋白执行生理功能所需的Mg2+浓度，通过稳定核糖体的结构、活化乙酸硫激酶参与蛋白质和类脂的合成，以保持膜的完整性(杨福愉和黄芬1996)。铝胁迫也显著降低黑麦和小麦根尖线粒体Mg2+-ATP酶活性，黑麦中更明显，加入SNP显著提高Mg2+-ATP酶活性(图5)。

图5　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体Mg2+-ATP酶活性的影响Fig.5　Effects of SNP on mitochondrial Mg2+-ATPase activity ofrye and wheat root tip

2.5　SNP对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体呼吸功能的影响

线粒体呼吸III态(R3)为加入底物及ADP时快速耗氧期的耗氧速率，呼吸IV态(R4)为III态状态下ADP耗尽后的耗氧速率(其依赖于内膜通透性)，R3/R4之比值为呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR)(Puka-Sundvall等2000)。P/O比反映出呼吸过程中电子传递和氧化磷酸化耦联程度。P/O比和呼吸控

242 植物生理与分子生物学学报 32卷

制是反映线粒体功能的两个重要指标。

铝胁迫显著降低黑麦和小麦的R3，加入SNP后显著提高R3；但铝胁迫显著提高R4，加入SNP则显著降低R4 (图6、7)。对RCR而言，铝胁迫降低黑麦和小麦的RCR，但黑麦中下降更显著，加入SNP后，RCR显著提高(图8)。铝胁迫显著降低黑麦和小麦的P/O比，小麦中更明显，加入SNP则提高P/O比，小麦中更显著(图9)。从呼吸速率来看，铝胁迫显著降低黑麦和小麦的呼吸速率，加入SNP后，两者的呼吸速率均显著提高，变化幅度类似(图10)。OPR (oxygenated phosphate rate)也是表示线粒体呼吸链释放能量耦联将ADP合成ATP的效率，图

图6　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体R3的影响

Fig.6　Effects of SNP on mitochondrial R3 of rye and wheat root tip

图7　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体R4的影响

Fig.7　Effects of SNP on mitochondrial R4 of rye and wheat roottip

图8　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体RCR的影响

Fig.8　Effects of SNP on mitochondrial RCR of rye and wheat roottip

11表明铝胁迫显著降低黑麦和小麦的OPR，小麦中下降更大，加入SNP后则显著提高OPR。

图9　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体P/O的影响

Fig.9　Effects of SNP on mitochondrial P/O of rye and wheat root tip

图10　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体呼吸速率的影响Fig.10　Effects of SNP on mitochondrial respiratory rate of rye andwheat root tip

图11　SNP对黑麦和小麦根尖线粒体OPR的影响

Fig.11　Effects of SNP on mitochondrial OPR of rye and wheatroot tip

3　讨论

3.1　黑麦和小麦耐铝性差异及其与线粒体功能关系

根长实验结果表明黑麦King品种耐铝性较强，

小麦Jinmai47品种对铝较敏感(表1)，可以作为研究铝胁迫时的参照样品，而两者耐铝性差异与线粒体的适应有关。线粒体是细胞中产生能量的工厂，是

2期何虎翼等: 硝普钠对铝胁迫下黑麦和小麦根尖线粒体功能的影响 243

细胞进行正常生命活动的基础。当细胞内环境被破坏时，线粒体呼吸功能及代谢速率便会下降。铝胁迫下，黑麦和小麦的呼吸速率均显著下降(图10)，和其它小麦品种的结果一致(何龙飞等2001)，R3 (图6)、R4 (图7)、RCR (图8)、P/O (图9)、OPR (图11)显著下降，表明这时内膜透性及内膜上复合物受损，造成电子传递过程中电子漏失及电子传递受到障碍，线粒体功能严重受损，与Yamamoto等(2002)的结论一致，由此必然使ATP合成受到严重影响，而对根的生长产生抑制。van Remmen和Richardson(2001)也报告了铝胁迫可损伤线粒体结构和功能，影响多种代谢酶的活性，可以造成葡萄糖的氧化分解障碍，而且大量自由基还可损伤线粒体DNA及线粒体DNA聚合酶，影响呼吸链中各种酶及酶复合物的活性，干扰能量代谢(Graziewicz等2002)。同时，铝胁迫下，小麦的P/O、OPR下降幅度高于黑麦(图9、11)，但耗氧速率(图6、8)高于黑麦，表明小麦线粒体功能受损更为严重，这可能是黑麦较为耐铝的原因之一。

线粒体膜存在大量蛋白质，如Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、H+-ATP酶、H+-PP酶，这些蛋白质在建立跨线粒体膜电化学势梯度，保证物质跨膜运输，进行信号传导并作出反应具有重要的生物学意义(黄仲荪和曾昭淳2000)。实验结果表明，在铝胁迫下黑麦和小麦的H+-ATP酶(图1)、H+-PP酶(图2)、Na+-K+-ATP酶(图3)、Ca2+-ATP酶(图4)和Mg2+-ATP酶(图5)活性均有不同程度的降低，和其它小麦品种的结果相似(何龙飞等2001)，离子交换受到影响，跨膜离子梯度不能维持，胞外K+浓度上升,胞内Na+浓度及H2O增加，使静息膜电位绝对值降低，膜应激性下降，导致线粒体肿胀，影响线粒体功能。

3.2　SNP对铝毒害的缓解作用及可能机理

从实验结果可知，单独SNP处理能够促进黑麦和小麦根的伸长生长，铝胁迫下，加入SNP能够一定程度上缓解铝对根伸长的抑制(表1)。原因可能在于SNP作为供体，产生NO，而NO通过质外体直接作用于细胞壁组分，导致细胞壁松弛，从而促进细胞扩展(Leshem和Haramaty 1996)，还使得呼吸速率显著提高，R3 (图6)、RCR (图8)、P/O (图9)显著增加，OPR (图11)也回升，恢复R3，降低R4无效耗氧，从而促进铝胁迫下小麦的电子传递和

氧化磷酸化耦联作用，提高呼吸速率，通过补偿性代谢来部分适应铝胁迫的需要。这可能是SNP缓解铝胁迫机理之一。

加入SNP后，黑麦和小麦根尖线粒体膜H+-ATP酶、H+-PP酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶(图1~5)活性均明显提高，这可能与SNP增加胞内保护蛋白，或通过把O2¯·转变为ONOO-(Wendehenne等2004)，保护细胞，应对铝胁迫引起的氧化胁迫有关，使铝胁迫下线粒体膜功能得到一定程度恢复，而减缓铝毒害作用。

综上所述，SNP能够缓解铝对黑麦和小麦的毒害作用，且推测其是作为供体产生NO作用的结果，但由于NO是单电子分子，很活泼，能与超氧阴离子(O2·¯ )反应产生过氧亚硝酸根(ONOO－)等，对NO在植物体内作用的认识还很肤浅。NO是否能直接作用或者作为信号物质发挥作用？若是后者，则其信号传导途径，与其它信号的关系如何(Wendehenne等2004; Delledonne 2005)？尚需进一步研究。

参 考 文 献

Chavez JC, Pichiule P, Boero J, Arregui A (1995). Reduced

mitochondrial respiration in mouse cerebral cortex duringchronic hypoxia. Neurosci Lett 193(3): 169-172

Delledonne M (2005). NO news is good news for plants. Curr Opin

Plant Biol 8: 390-396

Graziewicz MA, Day BJ, Copeland WC (2002). The mitochondrial

DNA polymerase as a target of oxidative damage. NucleicAcids Res 30(13): 2817-2824

He LF(何龙飞) , Liu YL(刘友良), Shen ZG(沈振国), Wang AQ

(王爱勤) (2001). Effect of aluminum on respiratory rate andsome mitochondrial enzymes activities of wheat roots. ActaAgron Sin (作物学报) 27(6): 857-861(in Chinese)Huang ZS(黄仲荪), Zhen ZC (曾昭淳) (2000). Physiology and

Bio-chemistry (2nd ed). Chongqing: Chongqing UniversityPress 8-9 (in Chinese)

Leshem YY, Haramaty E (1996). The characterization and

contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetativestress and senescence of Pisum sativum Linn. foliage. J PlantPhysiol 148: 258-263

Li XF, Ma JF, Matsumoto H (2000). Pattern of aluminum-induced

secretion of organic acids differs between rye and wheat.Plant Physiol 123(4): 1537-1544

Li YR(李扬瑞) (1987).The activity of Mg2+-ATP and Ca2+-ATP in

cellular organ of sugarcane leaves. Plant Physiol Commun

244

(植物生理学通讯) 23(6): 20-22 (in Chinese)

Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2006, 32 (2): 239-244

(程玉香) (1999). Protective effect of cerium on mitochondriawheat under salinity stress. Chin Rare Earth Soc (中国稀土学报) 17(2): 187-190 (in Chinese)

Wendehenne D, Durner J, Klessig DF (2004). Nitric oxide: a new

player in plant signaling and defence responses. Curr OpinPlant Biol 7: 449-455

Yamamoto Y, Kobayashi Y, Devi SR, Rikiishi S, Matsumoto H

(2002). Aluminum toxicity is associated with mitochondrialdysfunction and the production of reactive oxygen species inplant cells. Plant Physiol 128: 63-72

Yang FY(杨福愉), Huang F(黄芬) (1996). Interaction of Fatness-Protein and Its Application on Medicine and Agriculture.Jinan: Shandong Science and Technology Press 1-55, 110-132 (in Chinese)

Ying XF(应小芳), Liu P(刘鹏), Xu GD(徐根娣) (2003). Progress

of study on aluminum in soil and its plant effect. Environment(生态环境) 12(2): 237-239 (in Chinese)

Zhang WH(章文华), Chen Q(陈沁), Liu YL(刘友良) (2002).

Relationship between H+-ATPase activity and fluidity oftonoplast in barley roots under NaCl stress. Acta Bot Sin(植物学报) 44(3): 292-296 (in Chinese)

+

Ohnishi T, Gall RS, Mayer ML (1975). An improved assay of

inorganic phosphate in the presence of extralabile phosphatecompounds：application to the ATPase assay in the presenceof phosphocreatine. Anal Biochem 69: 261-267

Puka-Sundvall M, Wallin C, Gilland E, Hallin U, Wang X,

Sandberg M, Karlsson JO, Blomgren K, Hagberg H (2000).Impairment of mitochondrial respiration after cerebralhypoxia-ischemia in immature rats: relationship to activationof caspase-3 and neuronal injury. Dev Brain Res 125(1-2):43-50

Ruan HH, Shen WB, Xu LL (2004). Nitric oxide modulates the

activities of plasma membrane H-ATPase and PPase inwheat seedling roots and promotes the salt tolerance againstsalt stress. Acta Bot Sin 45(4): 415-422

Shanghai Plant Physiology Association (上海植物生理学会)

(1985). Manual of Plant Physiology. Shanghai: ShanghaiScience and Technology Press 84-86 (in Chinese)van Remmen H, Richardson A (2001). Oxidative damage to

mitochondria and aging. Exp Gerontol 36(7): 957-968Wang JS(王金胜), Ji MX(冀满祥), Zhao RY(赵如意), Cheng YX

Effects of Sodium Nitroprusside on Mitochondrial Function of Rye andWheat Root Tip under Aluminum Stress

HE Hu-Yi, HE Long-Fei*, LI Xiao-Feng, GU Ming-Hua

Agricultural College, Guangxi University, Nanning 530005, China

Abstract: Sodium nitroprusside (SNP) could ame-liorate the inhibition effect of Al on root growth ofrye (Secale cereale L. cv. King) and wheat(Triticum aestivum L. cv. Jinmai47) (Table 1).Respiratory rate (Fig.10), P/O (Fig.9), OPR(oxygenated phosphate rate) (Fig.11), R3 (oxygenconsumption rate with ADP and substrate present)(Fig.6), R4 (oxygen consumption rate withsubstrate) (Fig.7) and RCR (respiratory controlratio, R3/R4) (Fig.8) of root tips from rye and wheatdecreased, as well as the activities of H+-ATPase(Fig.1), H+-PPase (Fig.2), Na+-K+-ATPase (Fig.3),Ca2+-ATPase (Fig.4) and Mg2+-ATPase (Fig.5), butthey increased with SNP treatment. It showed thatmitochondrial respiratory functions of root tips

from rye and wheat were damaged, phosphoryla-tion was un-coupled by Al, but that of rye was lessthan that of wheat. Rye has high Al-resistance abil-ity than wheat. SNP is one of donor of NO, it issuggested that NO can ameliorate remarkably res-piratory dysfunction resulted from Al stress, so thatNO can ameliorate the inhibition effect of Al onplant growth.

Key words: aluminum stress; sodium nitroprusside; rye; wheat;mitochondria; respiratory function

This work was supported by the National Natural Science Foundation ofChina (Nos.30360048, 30560070).

*Corresponding author (E-mail: [email protected]; Tel: 86-771-3237917).