纤维素酶活力测定

山东大学实验报告 2011年4月20日

姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 [1**********]7 同组者 于潜 科目 生物化学实验 题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法 仪器编号 105

一、 实验目的

1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、 巩固使用分光光度计

二、 实验原理

纤维素酶是一种多组分酶,包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素,CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成棕红色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

酶活力(enzyme activity)也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

本实验中酶活力定义:1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。

三、 实验器材

(1)722型分光光度计 (2)恒温水浴 (3)沸水浴锅 (4)电炉子 (5)剪刀 (6)分析天平

(7)试管架 (8)胶头滴管

(9)具塞比色管(25mL×10) (10)移液管 (2mL;5mL) (11)烧杯 (500mL×3) (12)洗耳球

四、 实验材料

(1) 纤维素酶:0.05g酶溶解定容至50ml,取1ml再定容至100ml待测(用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制);

(2) 3、5—二硝基水杨酸显色液;

(3) 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液(CMC):用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置; (4) 标准葡萄糖溶液(1mg/mL); (5) 蒸馏水。

五、 实验操作

1. 空白管的测定:

1

1毫升酶液,沸水浴5分钟,冷却加3毫升0.5%CMC;

2. 样品管测定:

取三支比色管,分别加入0.5%CMC 3毫升,酶液1毫升,混匀后与空白管一起于50℃水浴锅中水浴30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,冷却加入3毫升显色液,再沸水浴10分钟,冷却后加蒸馏水定容至25毫升,混匀,与标准曲线同时于550nm处测OD值。

3. 标准曲线绘制:

取6只25ml比色管,分别吸取0,0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于,6支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml。在550nm处比色测其OD值。以光密度为纵坐标,以葡萄糖微克数为横坐标,绘出标准曲线。 4. 计算酶活力:

在上述条件下,每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。

N ×OD值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位=———————————

`30×1

N---酶液的稀释倍数 30――糖化所用时间 1――反应酶液毫升数

六、 注意事项

1. 实验中由于比色管中溶液量过多,若用旋窝搅拌器混匀,可能使溶液溅出,可使用保鲜

膜,将其覆盖在比色管口,上下摇动比色管,进行混匀;

2. 分光光度计使用前应进行预热30min,使其发光稳定,且在无样品放置时,应使试样室盖

打开,此时光门自动关闭,以保护光电管;

3. 使用比色管时要将其擦拭干净,应用吸水纸吸去比色管表面溶液,用擦镜纸擦拭,以避

免对比色管光滑一面造成磨损。且测量时,不可以其磨砂面正对光源;

4. 在标准曲线制作时,应从低浓度到高浓度以此测量,因为低浓度的残留液对高浓度待测

液的测定不会有太大影响,所以可不用润洗比色管,但若有高浓度到低浓测定,则需要对比色管进行润洗,以消除误差,因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影响。

七、 实验结果

(一) 实验数据统计

2

(二) 图表分析

根据图表曲线拟合,由标准葡萄糖光吸收曲线所得公式为y = 0.0005865x-0.0069,根据三个样品管的A(550nm)值可得其葡萄糖含量为743.2,750.0,741.5ug,平均得744.9ug。

N ×OD值对应的葡萄糖量

纤维素酶活力单位=———————————=(100×744.9)/30=2483 ug/mg×min 30×1

则每克纤维素酶(固体)的活力单位数=2483×1000=2.48×106 ug/g×min

八、 分析讨论

1. 2. 3. 4. 5.

本次实验中有以下方面可能导致误差:

定容到25ml后未充分混匀,导致上层溶液浓度偏低,进而影响OD值测量; 使用比色杯时未充分润洗,影响测定;

空白管在沸水浴时未完全失活,会导致调零基准不准确,影响实验结果; 放入沸水浴是没有保证时间相同,会直接导致实验误差; 定容时应使液体完全冷却,否则宜出现误差;

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