免疫组化方法和步骤

免疫组化检测CD34+的表达

1基本原理

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

威斯腾生物 400-675-6758

（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），11515 min

（2）115 ℃×15 min；

（3）4%多聚甲醛500 gml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。

（4）mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；

：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA； （（原液1000 U/ml按1：99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；

（7）DAB工作液（临用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）

（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀释贮存液1 mg/ml）。

（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、

苏木素。

2主要仪器设备

电热压力蒸汽消毒器(XDD) 超净工作台 TC2323型CO2恒温孵箱 恒温烤箱 高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) 抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 磁力搅拌器(79-1) 0.22um纤维素滤膜 0.45um混合纤维素滤膜 1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) 细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 细胞计数板

光学显微镜倒置显微镜（照像系统浙江绍兴医疗器械总厂 苏州净化设备公司 美国SHEL LAB 公司 上海跃进医疗器械厂 美国Beckman公司 上海

德国BM德国BM

日本 日本 日本

切片机：德国Leica

德国Leica，HI1210型 德国Leica，HI1220型

3

3.1

1. APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

2. HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

3. Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液

中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

3.2常用酶消化：

1） 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

2） 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin30分钟。

3.3抗原热修复

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。

3.3.1 3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3容器内液体温度保持在92℃~98分钟（注意：无论是使用医用或家用微。取出容器，室温冷却10~20分钟以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS

3.3.2 1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲5~6分钟后），计时1~2分钟，然PBS3

3.3.3 切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.3 免疫组化染色步骤：

1、石蜡切片脱蜡，100%二甲苯10minX 2,50%二甲苯 5min。 2、复水：无水乙醇 5minX 2；95%乙醇5min；90%乙醇5min；80%乙醇5min；70%乙醇5min，蒸馏水洗涤5min。

3、3%H2O2室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

4、PBS浸泡5分钟×3次

5、抗原修复：加入0.2%Triton X-100室温下4分钟，弃去液体，0.5%Triton X-100室温下10分钟，PBS冲洗，5分钟×3次。

6、6％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

7、PBS浸泡5分钟×3次。

8、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），3730第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

9、PBS冲洗，5分钟×3次。

10、 ，3710~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37

11、 PBS冲洗，5分钟×3次。

12、 显色剂显色：DAB ）

13、PBS洗 2次 5 min。

14、苏木素复染

15

16，95，100%各3min。

17次3min。

18