RNAi实验中脱靶效应(Off-Target Effect)

要想了解脱靶效应的由来以及如何有效的避免脱靶效应，我们首先需要了解RNAi 的机理。在早期的研究中，人们对于RNAi 的机理了解如下图示：dsRNA 被Dicer 剪切加工成为siRNA ，siRNA 的双链中的反义链参与RISC 的结合进而沉默靶基因的表达(狭义的基因沉默理论) 。目前更为广义的RNAi 机理应当包括了microRNA 途径所造成的基因表达抑制现象，microRNA 最近几年被极大的关注并赋予了非常高的研究热情和评价，通过microRNA 途径可以不受完全完全互补的限制而调控大量靶基因的表达，由此引发的关于siRNA 反义链如何避免进入microRNA 途径的脱靶效应，这个问题在后面的跟贴中会有说明。回过头来看看这种狭义的RNAi 机理，试想想，这种这样的一个标准的双链siRNA ，事实上它的两条链均能够参与RISC 的结合，也就是说，这样的双链siRNA 可以引发由正义链所介导的脱靶效应（理论上和正义链互补配对的靶基因均能被沉默），如何解决正义链所引发的脱靶效应呢？因此，当我们尝试着应用这样的标准siRNA 双链产品去沉默靶基因，并万分激动的检测到靶基因确实被沉默70％甚至更高的时候，你是否考虑到，还有千千百百的基因有可能被非特异的表达上调或者下调，这就是生物学的真实事件。想象一下，如果这些大量非特异性表达的基因正好和我们所研究的基因有着某种关联性（比如正好是我们所研究的某个信号通路的关键分子），这样的实验结果我们还有多少信心作出科学的结论呢？

Off-garget effects(脱靶效应) 最早是Dharmacon 科学家的Jackson 和他的同事们提出（Fedorov, Y ., et al. "Off-targeting By siRNA Can Induce Toxic Phenotype." RNA Accepted

(2006).）给细胞转染特定基因的单条siRNA 后运用全基因组芯片检测技术鉴定表达上调/下调1.5到3倍的靶基因数量，研究人员发现在这种情况下有大量的基因被非特异性的调控着。siRNA 正义链和反义链与脱靶基因的互补水平有高有低，并且每条siRNA 所引发的脱靶基因表达谱也不尽相同，反映了序列依赖性的脱靶效应。

事实上，通过生物信息学来降低序列依赖性脱靶效应确实是每个人在面临这个问题的第一想法。下面这篇2006年的Nature Method 文章或多或少可以说明一些问题。研究人员用Smith-Waterman 比对软件预测了不同条件下的脱靶基因（见下图），然后和全基因组芯片检测真实的脱靶基因比较发现：用生物信息学预测得到的脱靶基因的数量远远高于实际的脱靶基因数量，更加可悲的是，用生物信息学预测得到的如此大量的脱靶基因中，真实的脱靶寥寥无几，也就是说，真实的脱靶效应90％左右是用生物信息学无法预测和排除的。

Figure . Maximum sequence alignment does not accurately predict off-targeted gene regulation by RNAi.

Venn diagram shows overlap between 347 experimentally identified off-targets and in silico off-targets predicted by the Smith-Waterman alignment algorithm. Black, 347 experimentally validated off-targets for 12 separate siRNAs. Red, green and blue represent the number of off-targets predicted by Smith-Waterman using 79% (for example, 15/19 or better), 84% (for example, 16/19 or better) and 89% (for example, 17/19 or better) identity filters, respectively. The numbers 23, 7 and 1 represent the number of genes that are common between the experimental and predicted groups at each of the identity filter levels (79%, 84% and 89%, respectively)http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n3/full/nmeth854.html

原文地址:http://www.seekbio.com/biotech/exp/molbio/RNA/2010/x819354732.html