沙利度胺抑制小鼠T淋巴瘤的实验研究

　　[摘要] 目的 观察沙利度胺对小鼠T淋巴瘤的抑制作用。 方法 32只BALB/C小鼠皮下接种鼠T淋巴瘤白血病细胞（EL-4细胞）建立模型，第2天随机分成4组，每组8只：①阴性对照组：小鼠8只，生理盐水灌胃25 mL/（kg·d）；②低剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃50 mg/（kg·d）共14 d；③中剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃200 mg/（kg·d）共14 d；④高剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃400 mg/（kg·d）共14 d。每2日测肿瘤直径，计算体积，用药后15 d处死小鼠，分离肿瘤，计算抑瘤率。第2批小鼠同样方法处理，记录平均生存期。用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数。RT-PCR法测TNF-α mRNA表达。 结果 各组瘤重较阴性对照组减小，抑瘤率分别为17.75%，36.73%，42.04%，差异有统计学意义（P 　　[关键词] 沙利度胺；淋巴瘤；TNF；凋亡 　　[中图分类号] R733.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0123-03 　　恶性淋巴瘤在我国虽然发病率不高，但恶性程度高，预后较差，特别是T细胞淋巴瘤经综合治疗5年生存率仅为30%[1]。沙利度胺（反应停，酞咪哌啶酮，Thalidomide）因导致胎儿畸形于20世纪60年代被禁用。1994年以来研究发现其具有调节机体免疫，抑制肿瘤血管生成等作用而用于多种肿瘤的治疗[2]。本文观察了沙利度胺对小鼠移植性T淋巴瘤的抑制作用，为其更好地应用于临床提供一定的实验依据。 　　1 仪器与材料 　　1.1 细胞株及实验动物 　　BALB/C纯系雌性小鼠，体重18～22 g，6～8周龄，购于河南省实验动物中心。EL-4细胞（鼠T淋巴瘤白血病细胞株）购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。 　　1.2 药品、试剂、仪器 　　沙利度胺由常州制药厂生产，批号：0508241。原位细胞凋亡检测试剂盒（POD），购自华美生物工程公司。TNF-α引物由上海生工生物有限公司合成，上游引物序列：5'-AGT CCG GGC AGG TCT ACT TT-3'，下游引物：5'-GCA CCT CAG GGA AGA GTC TG-3'，扩增产物为422 bp。β-actin上游引物序列：5'-CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3'，下游引物序列：5'-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3'，扩增产物为276 bp。Trizol购于invitrogen公司，rTag酶购于TaKaRa公司。 　　2 方法 　　2.1 模型的建立 　　EL-4细胞悬浮生长于含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液置培养箱。培养条件：37℃，5%CO2。选生长对数期细胞用于实验，无菌生理盐水调细胞浓度为5×106个/mL。取悬液0.2 mL接种于32只BALB/C小鼠右腋部皮下。 　　2.2 抑瘤率实验 　　接种后第2天，将32只小鼠随机分为4组，每组8只。①阴性对照组：小鼠8只，生理盐水灌胃25 mL/（kg·d）共14 d；②低剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃50 mg/（kg·d）共14 d；③中剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃200 mg/（kg·d）共14 d；④高剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃400 mg/（kg·d）共14 d。观察小鼠体重，并用游标卡尺测肿瘤直径，计算肿瘤体积。于用药后第15天处死小鼠，分离肿瘤，计算抑瘤率。第2批32只小鼠同样方法建立模型分组记录平均生存期。公式：瘤体积=ab2/2（a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径）；抑瘤率=（对照组瘤重-给药组瘤重）/对照组瘤重×100%。 　　2.3 HE染色 　　将石蜡切片，常规脱蜡、乙醇梯度脱水，苏木素-伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。 　　2.4 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡 　　取肿瘤组织，10%福尔马林固定24 h，脱水包埋，4 μm连续切片，按试剂盒说明操作。显微镜下观察：以细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：凋亡细胞占全部肿瘤细胞的比例，在高倍镜下计数每100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，每例至少计数1000个肿瘤细胞，取其平均数。 　　2.5 RT-PCR法检测TNF-α mRNA的表达 　　2.5.1 常规提取肿瘤组织RNA 用TaKaRa公司cDNA第一链合成试剂盒（First Strand cDNA synthesis kit）合成cDNA第一链，参照说明书操作。 　　2.5.2 25 μL PCR扩增体系 DDH2O 14.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，TNF-α上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，dNTP 2 μL，Taq 酶1 μL。 　　2.5.3 PCR扩增条件 预变性：94℃ 2 min，变性：94℃ 30 s，退火温度55.6℃，退火时间30 s，72℃延伸1 min，进行30个循环后，再72℃继续延伸5 min，置4℃保存。 　　2.5.4 电泳 1%琼脂糖电泳，5 V/cm，电泳时间20 min，观察PCR产物，照像，计算机系统分析光密度，计算表达量。公式：TNF-α mRNA相对表达量=扩增产物的光密度值TNF-α/扩增产物光密度值β-actin×100%。 　　2.6 统计学方法 　　采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组之间用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P 　　3 结果 　　3.1 沙利度胺对荷瘤小鼠的抑瘤作用 　　沙利度胺各组瘤重与对照组相比减小，低、中、高剂量组抑瘤率分别为：17.75%，36.73%，42.04%。各组平均生存期较阴性对照组延长，差异有统计学意义（P 0.05）。结果见表1。 　　3.3 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡结果 　　TUNEL细胞凋亡检测试剂盒可将处于不同阶段的凋亡细胞DAB显色后显示出来，本实验中沙利度胺各组小鼠肿瘤组织中散在分布着孤立的细胞核黄染或有棕黄色颗粒的细胞即凋亡细胞，其中，中高剂量组AI明显高于阴性对照组（P 　　3.4 RT-PCR法检测TNF-α mRNA结果 　　以β-actin做内参照，图像分析得出各组移植瘤组织中TNF-α mRNA相对表达量，可见沙利度胺各剂量组肿瘤组织中TNF-α mRNA表达水平低于阴性对照组肿瘤组织，差异有统计学意义（P 　　4 讨论 　　沙利度胺是一个谷氨酸衍生物，化学名称是N-（2，6二氧-3-哌啶基）-邻苯二甲酰亚胺。目前临床用于治疗多发性骨髓瘤，肾癌等取得一定疗效[3]，但有关治疗淋巴瘤报道较少。本实验中荷瘤鼠口服沙利度胺50～400 mg/kg，移植瘤体积缩小，抑瘤率分别是17.75%，36.73%，42.04%，各组小鼠生存时间明显延长，较对照组比较差异有统计学意义（P 　　目前认为，肿瘤的发病与细胞凋亡的失衡直接相关。孙萍等[5]报道沙利度胺有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本实验中TUNEL法检测肿瘤凋亡，镜下观察，治疗组可见肿瘤细胞凋亡，形成凋亡小体，凋亡小体被周围吞噬细胞吞噬、降解。肿瘤组织有轻度白胞浸润和局灶性坏死。中高剂量组癌细胞AI明显高于对照组，提示沙利度胺通过诱导T淋巴瘤细胞凋亡起到抑制肿瘤生长的作用。 　　TNF-α具有介导炎症和免疫调节作用，其效应包括激活淋巴细胞、释放其他细胞因子（如IL-1、IL-6）、前列腺素和金属蛋白酶；也可以促进血管形成和调节黏附分子作用。Majumder等[6]报道沙利度胺可以通过下调TNF-α的表达，从而抑制下游因子分泌，起到抑制肿瘤的作用。本实验中RT-PCR法检测移植瘤组织的TNF-α mRNA表达，发现沙利度胺处理组肿瘤组织TNF-α mRNA表达下降，较对照组差异有统计学意义（P 　　总之，文献报道[7-8]沙利度胺抗肿瘤机制复杂，可能与抑制微血管的生成，减少TNF-α的合成，降低IL-6的产生，抑制整合素的表达等有关。近年来，沙利度胺在临床研究中取得了更肯定的疗效：顾爱琴等[9]报道，沙利度胺联合NP方案化疗治疗晚期非小细胞肺癌可以提高化疗疗效，延长中位生存期，减轻化疗引起的呕吐反应。刘金等[10]研究发现沙利度胺联合同步放化疗治疗小细胞肺癌有增加放疗敏感性，提高局部控制率的作用。因此，对其衍生物——来那度胺的研究也成为热点。Zinzani等[11]报道来那度胺联合利妥昔单抗治疗复发性弥漫大B细胞淋巴瘤可以提高疗效。Zabransky等[12]的研究表明来那度胺对前列腺癌的治疗有确切疗效。在多发性骨髓瘤等血液病的研究中，McCarthy等[13]报道来那度胺对骨髓移植后的患者维持治疗，可以降低复发，延长生存期。 　　本实验结果表明，沙利度胺可能通过诱导T淋巴瘤细胞的凋亡、抑制TNF-α的表达而发挥双重抗肿瘤生长的作用，沙利度胺及其衍生物因其价格低廉，服用方便，副反应少，有望成为治疗淋巴瘤的有效药物，但尚需要临床进一步研究证实。 　　[参考文献] 　　[1] Qin Y，Shi YK，He XH，et al. Clinical features and prognostic factors of angioimmunoblastic T cell lymphoma[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2010 ，32（6）：448-451. 　　[2] 于燕霞，石远凯.沙利度胺在恶性肿瘤治疗中的应用[J].癌症进展杂志，2005，3（4）：353-359. 　　[3] Hicks LK，Haynes AE，Reece DE，et al. A meta-analysis and systematic review of thalidomide for patients with previously untreated multiple myeloma[J]. Cancer Treat Rev，2008，34（5）：442-452. 　　[4] Beckers MM，Huls G. Therapy refractory angioimmunoblastic T-cell lymphoma in complete remission with lenalidomide[J]. Eur J Haematol，2013，90（2）：162-163. 　　[5] 孙萍，张良明，孙等军，等.沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用[J].中华肿瘤杂志，2009，31（8）：582-586. 　　[6] Majumder S，Sreedhara SR，Banerjee S，et al. TNF α signaling beholds thalidomide saga：a review of mechanistic role of TNF-α signaling under thalidomide [J]. Curr Top Med Chem，2012，12（13）：1456-1467. 　　[7] Prommer EE. Palliative oncology：thalidomide [J]. Am J Hosp Palliat Care，2010，27（3）：198-204. 　　[8] Sissung TM，Thordardottir S，Gardner ER，et al. Current status of thalidomide and CC-5013 in the treatment of metastatic prostate cancer [J]. Anticancer Agents Med Chem， 2009，9（10）：1058-1069. 　　[9] 顾爱琴，韩宝惠，张雪艳，等.沙利度胺联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的随机研究[J].中华肿瘤杂志，2009，31（4）：298-301. 　　[10] 刘金，黄京子，余淑坤，等.同步放疗、化疗联合沙利度胺治疗小细胞肺癌的临床研究[J].中国医药导报，2009，6（5）：24-25. 　　[11] Zinzani PL，Pellegrini C，Gandolfi L，et al. Combination of lenalidomide and rituximab in elderly patients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma： a phase 2 trial[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk，2011，11（6）：462-466. 　　[12] Zabransky DJ，Smith HA，Thoburn CJ，et al. Lenalidomide modμLates IL-8 and anti-prostate antibody levels in men with biochemically recurrent prostate cancer [J]. Prostate，2012，72（5）：487-498. 　　[13] McCarthy PL，Owzar K，Hofmeister CC et al. Lenalidomide after stem-cell transplantation for mμLtiple myeloma[J]. N Engl J Med，2012，366（19）：1770-1781. 　　（收稿日期：2013-04-23 本文编辑：卫 轲）