双荧光报告系统

报告基因

Promega中文通讯 第2期 2002

荧光素酶

双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介 绍

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。

使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光 素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温

下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。 理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固 有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

双荧光素酶报告基因测试化学

荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增强快速酶转换来提高反应动力学 (5), 导致持续的"闪烁"发光信号 ( 图 2) 。

图 1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

海洋腔肠荧光素酶，一个 36 kDa单亚基蛋白质，纯化自天然来源的 Renilla reniformis (6)，含有3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作为遗传报告基因。海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用O 2 和海样腔肠荧光素

(coelenterazine) (图1)。当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减(图2)。

在 DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照" 报告基因)。因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/翻译反应。

萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可测定≤1fg (大约10 -20 摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。用双荧光素酶报告基因测试系统， 海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是≤ 10fg (大约3×10 -19 摩尔)的对照报告基因酶(图3B)，并且这两个酶的特异活力相似。

图 2 用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光。CHO细胞(1×10 6 /60mm培养板)共转染pGL3

Control和pRL SV40载体DNA。细胞用PBS洗涤后，加入400μl PLB制成裂解液。将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪)。100μl Stop &Glo TM 试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素

酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪)。Turner Designs 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射，12秒内完成两次测试。 双荧光素酶报告基因测试系统的方式

定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行， 不需将样品分成小组分或作额外的处理。因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪。

通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明。起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II (LAR II)混合。在完成萤火虫荧光素酶测试时，此时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入Stop & Glo TM 试剂到样品管。在1秒钟内，Stop & Glo TM 试剂湮灭大于10 5 滴度萤火虫反应的发光信号(图5)，并同时激活海洋腔肠荧光素酶。

图 3 萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围。纯化的萤火虫和Renilla荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀释，配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光，在最初2秒的预读延迟后。直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片。在含10fg和100fg的Renilla荧光素酶反应中

测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号。两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图。

图 4 用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方式。如荧光照度仪配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中，随后按序自动加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 试剂。

PLB裂解液

PLB裂解液 (Passive Lysis Buffer)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。尽管PLB设计应用于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使用常规处理方法制作的裂解液。无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到PLB裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的 (图6)。被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水平的非酶促发光 (自发光)，这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有特点。通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光，包括Triton? X-100, Promega的细胞培养裂解试?(CCLR) 和报告基因裂解试剂(RLB)，这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的发光反应。PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，

可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶。另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试。

图 5双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Renilla荧光素酶发光。CHO细胞裂解液有共转染pGL3 -Control和pRL SV40载体DNA，按图2描述的方法制备。萤火虫荧光素酶(报告基因1) 和Renilla荧光素酶 (报告基因2) 活力检测在10秒内完成，最初有2秒的预读延迟。为了显示Stop & Glo TM 试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop & Glo TM 试剂 (缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应)，萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Renilla荧光素酶发光。在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未湮灭反应值的0.0004%

图 6 用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB，温和摇动培养液达15分钟 (被动细胞裂解)，或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80℃进行 1次冻/融循环(主动细胞裂解)。萤火虫和Renilla荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示。为了便于比较，报告基因活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。图A：萤火虫荧光素酶报告基因活力。图B：Renilla荧光素酶报告基因活力。

海洋腔肠荧光素酶对照载体 pRL系列

设计的 pRL载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型 地 表达海洋腔肠荧光素酶。这些载体含有克隆自 Renilla reniformis (7)海洋腔肠荧光素酶的cDNA (R luc )，在R luc 基因中导入了3个碱基替换， 消除了内 Bgl II, Bam H I和 Nar I 酶切位点，这些突变不造成海洋腔肠荧光素酶表达的氨基酸序列的改变。提供的pRL载体有几种启动子构型，可同萤火虫荧光素酶载体组合， 作为报告基因活力的内对照。

pRL-TK

载体 pRL-TK (图9)，在Rluc上游含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶 (HSV-TK) 的启动子区域。HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳组织细胞中，可低水平和组成型地表达(8, 9)。 pRL-SV40

载体pRL- SV40含SV40早期增强子/启动子区域，在多种细胞中，可高强度、组成型表达Rluc。载体pRL- 40还含有SV40的复制起始区，在诸如COS-1或COS-7细胞中(10)，可瞬时、附加体式地复制，表达SV40大抗原。

pRL-CMV

载体pRL-CMV含CMV早早期增强子/启动子区域， 在多种细胞类型中，可高强度、组成型表达Rluc。在转基因小鼠中，CMV增强子/启动子具有泛主特点，在检测的 28种小鼠组织中， 24种有转录活力。

pRL-Null

载体 pRL-null无真核启动子和增强子序列，在Rluc上游有一些单一酶切位点，可提供最大灵活性来克隆所需的启动子序列，启动海洋腔肠荧光素酶的表达。

图9所显示的pRL-TK载体代表了pRL载体所共有的特点，在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子，可提供海洋腔肠荧光素酶的增强表达。内含子由人β-珠蛋白质内含子1的5′-供体剪切位点和免疫球蛋白基因重链可变区域的分枝点和3′-受体剪切位点组成

(12)。供体和受体剪切位点、分枝点的序列均作了改变以匹配最适剪切位点的共有序列(3)。在Rluc的紧上游是T7 启动子序列，可在体外合成海洋腔肠荧光素酶的转录物。Rluc的下游是SV40晚期poly (A)序列, 提供有效的转录终止和mRNA多腺苷酸化(14)。载体含有原核的复制起始区和β-内酰胺酶基因，可在大肠杆菌中选择质粒的扩增。

图 8 用Passive Lysis Buffer 制备细胞裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶的稳定性。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染培养在标准6孔板中的CHO细胞 (2.5 ×10 5 细胞/孔) 。培养30小时后，将培养液吸干，每孔中的附着细胞用PBS洗涤一次。制备裂解液时加入500μl Passive Lysis Buffer到每一个培养板中，在室温温和地震荡15分钟。立即测试小组份的每一种裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶活力，然后分装，保存在 22℃(室温)、4℃，或-20℃。保存的样品在指示的时间间隔内重新测试。测试按图5所描述的方法进行，每一个方框代表3个重复的细胞裂解物，作2次重复测试的均值。

图 9 pRL-TK载体的环形图。附加描述：内含子的位置，Rluc ，编码Renilla荧光素酶的cDNA，Ampr, 在E.coli中编码氨苄抗性，ori, 在E.coli中质粒复制起始区。Rluc和Amp r基因中的箭头表示转录的方向。

小 结

在双遗传报告基因的应用中，一个报告基因活力的改变，与基因表达的特定实验条件相关，而第二个报告基因的组成性活力提供了内对照，使实验值可以规一化。 Promega的新的双报告基因测试系统，在单管中测试两个荧光素酶报告基因，此两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围、和仪器需要。荧火虫和海洋腔肠荧光素酶测试的组合，匹配pRL载体，提供了双遗传报告基因应用的理想测试系统。使用标准的手工荧光照度仪可在30秒内完成测试。特别设计的新的被动裂解液，可快速、高效地将培养在多孔板中的细胞裂解，并使萤火虫和海洋腔肠荧光素酶具有最适测试灵敏度和稳定性。双报告基因测试系统在体内报告基因应用的优势，也同样体现在无细胞系统的应用，比如体外转录/翻译反应。

1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？

DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

2.有哪些海肾荧光素酶载体？

海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：

a. pRL-SV40载体

pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。

b. pRL-CMV载体

pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 c. pRL-TK载体

pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。

d. pRL-null载体

pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。

3.用双报告基因有何优点？

一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点？ 用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：

 快速

DLR测试不需保温或对样品作预处理。用被动裂解液将共转染有萤火虫及海肾荧光素酶基因的细胞裂解，制备细胞抽提物。加入Stop&Glo试剂后，可同时湮灭萤火虫荧光素酶活力并激活海肾荧光素酶发光，需立即测试海肾荧光素酶活性。在几秒钟内可完成荧光素酶测试实验并作定量测试。而其他一些如CAT及β-gal的报告基因系统在定量前需要长时间的保温。

 灵敏度

萤火虫及海肾荧光素酶的测试线性范围，是酶浓度的7个对数。其他报告基因的灵敏度及线性应答受限。通常不存在内源荧光素酶使背景活力低。

 方便

在单管中完成测试，不需拆分样品，可用被动裂解液将培养在96孔板中的细胞快速裂解。

5.海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶相比的相对活性如何？

在ATP，镁，及氧存在时，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而来源于海洋腔肠（Renilla reniformis）的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。

6.将两个报告基因载体作共转染应用什么条件？

当用双荧光素酶报告基因测试系统来测量等重量的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶时，可观察到它们释放的光几乎相等。萤火虫荧光素酶的分子量为61kD，而海肾荧光素酶的分子量为36kD，当测试等重量的两个

酶时，所测的海肾荧光素酶分子实际多69%。如以每摩尔为基础，据实验确定，用双荧光素酶报告基因试剂测试的萤火虫荧光素酶的荧光强度比海肾荧光素酶强大约53%。

共转染质粒所含启动子间的反式效应有可能会影响到报告基因的表达。当对照或实验报告基因载体含有很强的启动子/增强子时，需要特别加以注意。载体pRL上的TK，SV40，CMV调节因子据报道可在大多数哺乳类细胞中表达，但它们在不同细胞中的表达水平不同。载体pRL-TK中HSV胞嘧啶激酶启动子相对较弱，使海肾荧光素酶的组成性表达成低到中度水平。早SV40极早CMV的增强子/启动子转录水平高，当实验载体所具有的调节因子较强时，这类启动子不太适用于双报告基因实验。

为使实验报告基因及对照报告基因的基因表达相对独立，每次实验时转染混和液中载体DNA的量及共转染报告基因载体的比例需作优化。可采用实验载体与共转染报告基因载体的组成比在10：1到50：1或更大的范围，这有利于抑制启动子间的交互作用。有时为有利于实验，共转染混和液中的实验载体应选择为少量部分。

7.需用荧光测试仪对双荧光素酶报告基因测试系统的荧光素酶作测定吗？

作DLR测试时应使用荧光测试仪。液闪仪的灵敏度相比太低，不易获得可重复的结果。

8.作荧光素酶报告基因测试时，如何使用单或双加样的荧光测试仪？

对于单加样的荧光测试仪，在管子中预先加入荧光素酶测试试剂II，再加入细胞裂解物并测萤火虫荧光素酶的活力，接下来，用荧光测试仪上的加样管加入Stop&Glo试剂，并测海肾荧光素酶的活力。

对于双加样的荧光测试仪，在管子中加入细胞裂解物后，放入荧光测试仪中，从加样管I中加入荧光素酶测试试剂II并测萤火虫荧光素酶的活力，从加样管II中加入Stop&Glo试剂，并测海肾荧光素酶的活力。 需对背景作预测试的荧光测试仪需关闭这一功能。

9.如何从荧光测试仪中清理Stop&Glo试剂？

Stop&Glo试剂中的一个荧光素酶湮灭成份对塑料物质有一定的亲和力。这一组份对于自动加样管的塑料管及吸管的内壁有可逆结合。接触过Stop&Glo试剂的加样管如没充分清洗，会将残留的湮灭试剂遗漏到随后通过加样管的溶液中。如这样的情况发生，则非常少量的污染湮灭试剂就会极大地抑制萤火虫荧光素酶的活力。因此在使用萤火虫荧光素酶测试中，如要用自动法加样LARII，则需对已接触Stop&Glo试剂的加样管作充分的清洗。如荧光测试仪有两个加样管，则要将每个管子固定加样一种溶液。在完成一次实验后必须彻底清洗，请按下面的步骤清洗管子并维修仪器。

普通加样管清洗步骤：

1. 用3倍于吸管箱体积的去离子水反复清洗加样管子以除去Stop&Glo试剂。

2. 准备70%的乙醇作为清洗试剂，用5ml70%的乙醇将箱及加样管完全清洗，可将加样管浸泡在这一溶

液30分钟后，再用去离子水清洗。

注意：构造加样管子的材料有很大差异，有的吸管浸泡清洗试剂的时间需超过30分钟。配有Teflon管子的荧光测试仪不会有太大问题，而其他如Tygon浸泡清洗试剂的时间需超过12-16小时（过夜）以完全除去Stop&Glo试剂。

3. 用3倍于吸管箱体积的去离子水反复清洗加样管子以除去乙醇。

Turner Designs TD –20/20荧光测试仪中加样管的清洗:

TD –20/20荧光测试仪需5次预循环以100%地将加样吸管中的溶液完全清除，然后按下列方法清除残留的Stop&Glo试剂：

1. 用去离子水清洗吸管10次，清除残留的Stop&Glo试剂。

2. 再用70%乙醇清洗10次，并用清洗液将管子浸泡30分钟。

3. 再用去离子水清洗10次，清除残留的乙醇。

10.如何保存Stop&Glo试剂？

将一定体积的Stop&Glo试剂保存在玻璃管及硅化的聚丙烯管子中，放在-70C。在未作处理的塑料管中，这一试剂不稳定。

11.50×Stop&Glo底物储存液的保存条件已作改变！1999二月。

Stop&Glo底物溶于Stop&Glo底物试剂中，所得50×贮液在-20C会沉淀。当沉淀发生时，50×贮液的颜色会改变，如用于测定海肾荧光素酶，则酶活力会降低。

最好新鲜配制50×贮液，并立即使用，如需保存，则将50×贮液保存-70C达4周，活力不会改变。

12.被动裂解液与报告基因裂解液及细胞培养裂解试剂有何差别？这三种裂解液能同双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）一同使用吗？

被动裂解液经特别配方以最有效地减小海肾荧光素酶底物海肾荧光素的自发荧光水平。两个荧光素酶在被动裂解液中，室温可保存6小时。报告基因裂解液原则上可用于制备细胞裂解物，并用于DLR测试，但实际上这不可行，因较被动裂解液会导致高一些的海肾荧光素的自发荧光水平。细胞培养裂解试剂的海肾荧光素的自发荧光水平很高，不能被采用于制备DLR测试系统的细胞裂解物。

13.被动裂解液能裂解培养的植物细胞吗？它能裂解哺乳动物组织所得的初级细胞吗？

被动裂解液不能裂解植物细胞。它能裂解一些类型的哺乳初级细胞。一种细胞能否被它裂解需作测试。

14.加入Stop&Glo试剂后，还残留有萤火虫荧光素酶活性吗？

萤火虫荧光素酶能立即被Stop&Glo试剂湮灭，残留有萤火虫荧光素酶活性低于0.001%。

15.荧光素酶测试试剂II是否是荧光素酶测试系统的同一试剂？

荧光素酶测试试剂II不是荧光素酶测试系统的同一试剂。荧光素酶测试试剂II经特定配方与Stop&Glo试剂混合，以最有效地测试海肾荧光素酶活性。普通荧光素酶测试试剂不能替代用于DLR系统。

16.在测试阶段海肾荧光素酶活性的逐步丧失会使结果有何波动？

当用自动加样管加Stop&Glo试剂时，不会带来波动。用手动加Stop&Glo试剂时，据观察，海肾荧光素酶测试结果的波动可被忽约。

ooo

案

虫荧光素酶 luciferase

亦称发光酶。是催化生物发光的酶系的总称。它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时，底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分。现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多。它们属于加氧酶（oxygenase），不含金属和辅酶。对于发光，有的酶必须以ATP等作为辅助因子，有的则不需要。其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异，虫萤光素酶具有高度的特异性，一般仅作用于来自近缘种的虫荧光素。当然，萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的。海萤的虫荧光素酶在干燥状态下相当稳定，可以保存 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术

在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介 绍

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。

使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光 素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。

理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固 有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

双荧光素酶报告基因测试化学

荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增强快速酶转换来提高反应动力学 (5), 导致持续的"闪烁"发光信号 ( 图 2) 。

图 1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

海洋腔肠荧光素酶，一个 36 kDa单亚基蛋白质，纯化自天然来源的 Renilla reniformis (6)，含有3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作为遗传报告基因。海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用O 2 和海样腔肠荧光素

(coelenterazine) (图1)。当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减(图2)。

在 DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照" 报告基因)。因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/翻译反应。

萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可测定≤1fg (大约10 -20 摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。用双荧光素酶报告基因测试系统， 海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是≤ 10fg (大约3×10 -19 摩尔)的对照报告基因酶(图3B)，并且这两个酶的特异活力相似。

图 2 用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光。CHO细胞(1×10 6 /60mm培养板)共转染pGL3

Control和pRL SV40载体DNA。细胞用PBS洗涤后，加入400μl PLB制成裂解液。将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪)。100μl Stop &Glo TM 试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪)。Turner Designs 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射，12秒内完成两次测试。

双荧光素酶报告基因测试系统的方式

定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行， 不需将样品分成小组分或作额外的处理。因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报告基

因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪。

通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明。起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II (LAR II)混合。在完成萤火虫荧光素酶测试时，此时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入Stop & Glo TM 试剂到样品管。在1秒钟内，Stop & Glo TM 试剂湮灭大于10 5 滴度萤火虫反应的发光信号(图5)，并同时激活海洋腔肠荧光素酶。

图 3 萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围。纯化的萤火虫和Renilla荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀释，配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光，在最初2秒的预读延迟后。直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片。在含10fg和100fg的Renilla荧光素酶反应中测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号。两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图。

图 4 用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方式。如荧光照度仪配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中，随后按序自动加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 试剂。

PLB裂解液

PLB裂解液 (Passive Lysis Buffer)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。尽管PLB设计应用于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使用常规处理方法制作的裂解液。无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到PLB裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的 (图6)。被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水平的非酶促发光 (自发光)，这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有特点。通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光，包括Triton? X-100,

Promega的细胞培养裂解试?(CCLR) 和报告基因裂解试剂(RLB)，这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的发光反应。PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶。另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试。

图 5双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Renilla荧光素酶发光。CHO细胞裂解液有共转染pGL3 -Control和pRL SV40载体DNA，按图2描述的方法制备。萤火虫荧光素酶(报告基因1) 和Renilla荧光素酶 (报告基因2) 活力检测在10秒内完成，最初有2秒的预读延迟。为了显示Stop & Glo TM 试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop & Glo TM 试剂 (缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应)，萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Renilla荧光素酶发光。在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未湮灭反应值的0.0004%

图 6 用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB，温和摇动培养液达15分钟 (被动细胞裂解)，或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80℃进行 1次冻/融循环(主动细胞裂解)。萤火虫和Renilla荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示。为了便于比较，报告基因活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。图A：萤火虫荧光素酶报告基因活力。图B：Renilla荧光素酶报告基因活力。

海洋腔肠荧光素酶对照载体 pRL系列

设计的 pRL载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型 地 表达海洋腔肠荧光素酶。这些载体含有克隆自 Renilla reniformis (7)海洋腔肠荧光素酶的cDNA (R luc )，在R luc 基因中导入了3个碱基替换， 消除了内 Bgl II, Bam H I和 Nar I 酶切位点，这些突变不造成海洋腔肠荧光素酶表达的氨基酸序列的改变。提供的pRL载体有几种启动子构型，可同萤火虫荧光素酶载体组合， 作为报告基因活力的内对照。

pRL-TK

载体 pRL-TK (图9)，在Rluc上游含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶 (HSV-TK) 的启动子区域。HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳组织细胞中，可低水平和组成型地表达(8, 9)。

pRL-SV40

载体pRL- SV40含SV40早期增强子/启动子区域，在多种细胞中，可高强度、组成型表达Rluc。载体pRL- 40还含有SV40的复制起始区，在诸如COS-1或COS-7细胞中(10)，可瞬时、附加体式地复制，表达SV40大抗原。

pRL-CMV

载体pRL-CMV含CMV早早期增强子/启动子区域， 在多种细胞类型中，可高强度、组成型表达Rluc。在转基因小鼠中，CMV增强子/启动子具有泛主特点，在检测的 28种小鼠组织中， 24种有转录活力。

pRL-Null

载体 pRL-null无真核启动子和增强子序列，在Rluc上游有一些单一酶切位点，可提供最大灵活性来克隆所需的启动子序列，启动海洋腔肠荧光素酶的表达。

图9所显示的pRL-TK载体代表了pRL载体所共有的特点，在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子，可提供海洋腔肠荧光素酶的增强表达。内含子由人β-珠蛋白质内含子1的5′-供体剪切位点和免疫球蛋白基因重链可变区域的分枝点和3′-受体剪切位点组成(12)。

供体和受体剪切位点、分枝点的序列均作了改变以匹配最适剪切位点的共有序列(3)。在Rluc的紧上游是T7 启动子序列，可在体外合成海洋腔肠荧光素酶的转录物。Rluc的下游是SV40晚期poly (A)序列, 提供有效的转录终止和mRNA多腺苷酸化(14)。载体含有原核的复制起始区和β-内酰胺酶基因，可在大肠杆菌中选择质粒的扩增。

图 8 用Passive Lysis Buffer 制备细胞裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶的稳定性。用

pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染培养在标准6孔板中的CHO细胞 (2.5 ×10 5 细胞/孔) 。培养30小时后，将培养液吸干，每孔中的附着细胞用PBS洗涤一次。制备裂解液时加入500μl Passive Lysis Buffer到每一个培养板中，在室温温和地震荡15分钟。立即测试小组份的每一种裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶活力，然后分装，保存在 22℃(室温)、4℃，或-20℃。保存的样品在指示的时间间隔内重新测试。测试按图5所描述的方法进行，每一个方框代表3个重复的细胞裂解物，作2次重复测试的均值。

图 9 pRL-TK载体的环形图。附加描述：内含子的位置，Rluc ，编码Renilla荧光素酶的cDNA，Ampr, 在E.coli中编码氨苄抗性，ori, 在E.coli中质粒复制起始区。Rluc和Amp r基因中的箭头表示转录的方向。

小 结

在双遗传报告基因的应用中，一个报告基因活力的改变，与基因表达的特定实验条件相关，而第二个报告基因的组成性活力提供了内对照，使实验值可以规一化。 Promega的新的双报告基因测试系统，在单管中测试两个荧光素酶报告基因，此两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围、和仪器需要。荧火虫和海洋腔肠荧光素酶测试的组合，匹配pRL载体，提供了双遗传报告基因应用的理想测试系统。使用标准的手工荧光照度仪可在30秒内完成测试。特别设计的新的被动裂解液，可快速、高效地将培养在多孔板中的细胞裂解，并使萤火虫和海洋腔肠荧光素酶具有最适测试灵敏度和稳定性。双报告基因测试系统在体内报告基因应用的优势，也同样体现在无细胞系统的应用，比如体外转录/翻译反应

想请教各位:我在做双萤光报告系统,其中,实验载体和内参载体是按一定的比例进行共转染的。本来内参是用来监测转染效率的，我想问一下这个原理，如果在转染是，两个载体的比例是1:5，是不是转染后，两个载体在宿主细胞中的比例

就是1:5呢？原理是什么？

1）共转染相对效率较低。

2）转染后可以通过不同报告基因的检测方式各自进行检测。

3）多个质粒共转染的时候最好使用内参来标化实验用质粒的的转染，内参的选

择要采用不同于实验用的报告基因。PEGFP-C3只要能定量就可以。

以下为参考资料：

一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

当用双荧光素酶报告基因测试系统来测量等重量的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶时，可观察到它们释放的光几乎相等。萤火虫荧光素酶的分子量为61kD，而海肾荧光素酶的分子量为36kD，当测试等重量的两个酶时，所测的海肾荧光素酶分子实际多69%。如以每摩尔为基础，据实验确定，用双荧光素酶报告基

因试剂测试的萤火虫荧光素酶的荧光强度比海肾荧光素酶强大约53%。

共转染质粒所含启动子间的反式效应有可能会影响到报告基因的表达。当对照或实验报告基因载体含有很强的启动子/增强子时，需要特别加以注意。载体pRL上的TK，S40，CM调节因子据报道可在大多数哺乳类细胞中表达，但它们在不同细胞中的表达水平不同。载体pRL-TK中HS胞嘧啶激酶启动子相对较弱，使海肾荧光素酶的组成性表达成低到中度水平。早S40极早CM的增强子/启动子转录水平高，当实验载体所具有的调节因子较强时，这类启动子不太适用于双

报告基因实验。

为使实验报告基因及对照报告基因的基因表达相对独立，每次实验时转染混和液中载体DNA的量及共转染报告基因载体的比例需作优化。可采用实验载体与共转染报告基因载体的组成比在10：1到50：1或更大的范围，这有利于抑制启动

子间的交互作用。有时为有利于实验，共转染混和液中的实验载体应选择为少量

部分。（转贴）