基因测序技术基础原理
基因测序技术基础原理
DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序 PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为 10~40min。
由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1.BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。
2.pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L,试剂盒配套试剂。
3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。
4.DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。
5.引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6.灭菌去离子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离,PE公司产品。
8.3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。
9.70%乙醇和无水乙醇。
10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。
11.POP 6测序胶 ABI产品。
12.模板抑制试剂(TSR) ABI产品。
13.10×电泳缓冲液 ABI产品。
14.ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。
15.2400型或9600型PCR仪。
16.台式冷冻高速离心机。
17.台式高速离心机或袖珍离心机。
【操作步骤】
1.PCR测序反应
(1) 取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待测的质粒DNA 1μl -
pGEM-3Zf (+) 双链DNA - 1μl
待测DNA的正向引物 1μl -
M13(-21)引物 - 1μl
灭菌去离子水 2μl 2μl
总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
2.醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理。
(1) 加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心。
(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min),冰中骤冷,待上机。
4.上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1.ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为 1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为 (98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
相关文章
- 高通量测序技术及其在植物研究中的应用
- 第八讲二代测序技术(新)
- 基因检测的国际金标准是什么
- 一代.二代.三代测序技术
- 分子标记的发展及分子标记辅助育种
- 基因克隆的常用方法介绍
- 全基因组外显子测序及其应用
- 植物降解组测序研究进展
- 基因组测序技术
2012年第4期 辽宁林业科技 Journal of Liaoning Forestry Science &Technology 2012№4 高通量测序技术及其在植物研究中的应用 冯 (1. 辽宁省林业科学研究院,辽宁沈阳 健1, ...
二代测序技术 φX174:全长5,368bp Watson and Crick:DNA双螺旋 Fred Sanger:"DNA双脱氧链末端终止法" PCR技术,4色荧光标记代替同位素 1990-毛细管凝胶电泳 AB:自动 ...
基因检测的国际金标准是什么 sanger 测序是基因检测国际金标准. sanger 测序概念 分子生物学研究中,DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础.目前用于DNA 测序的技术主要有Frederick Sanger 发明的Sa ...
一代.二代.三代测序技术 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明.其基本原理是,聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来.一代测序实验的起始 ...
分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记),在杂交后代中准确地对不 ...
基因克隆的常用方法介绍 文章来源: 2006-7-19 17:22:13 基因克隆的常用方法介绍 生理科学进展 2000年第1期第31卷 综述 作者:孙春晓 于常海 单位:孙春晓(中国科学院上海生命科学研究中心,上海 200031):于常海 ...
遗姑HEREDITAS(Beijing)2011年8月,33(8):847-856 ISSN0253-9772 www.chinagene.ca 综述 DoI:10.3724/SP.J.1005.2011.00847 全基因组外显子测序及其 ...
广东农业科学2014年第3期 165 植物降解组测序研究进展 朱柳村1,张莹2 (1. 上海大学系统生物技术研究所,上海200444:2. 扬州泊瑞生物农业开发有限公司,江苏扬州225200)摘 要:微小RNA (miRNA )的靶标研究是 ...
第4章基因组测序技术 基因组测序 技术进展 DNA复制 DNA的复制为半保留复制.由于DNA单链复制延伸时只能以核苷酸单体的5'-磷酸基团与前一个核苷酸的3'-羟基缩合生成磷酸酯键.因此DNA复制是以5'3'方式进行. DNA 聚合酶 I ...