琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳

1.原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

2操作流程

准备干净的配胶板和电泳槽

琼脂糖凝胶电泳：水平电泳

注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

(1)电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

(2)凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

(3)缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。

(4)电压和温度

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

(5)DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

(6)DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

(7)Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

(8)凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

3回收编辑

(1)DNA片段的胶回收方法

电泳洗脱法

低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法

冻融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法

(2)胶回收注意事项

a.将电泳槽用ddH2O反复清洗干净，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液；

b.根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；

c.切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；

d.要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；

e.熔胶要完全。

loading buffer

loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液，6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫兰色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同；后面的兰色条带是二甲苯青，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。而对于PAGE胶他们的迁移速率也分别不同。

1.主要用途

loading buffer的功能主要有两个：

第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯青FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；

第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。

2.制备方法

loading buffer 一般配置：

(1) 6×Loading buffer:

30mM EDTA

36%(v/v) Glycerol

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.05%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于DNA电泳

(2) 10×Loading buffer:

30mM EDTA

50%(v/v) Glycerol

0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.25%(w/v) Bromophenol Blue

主要用于RNA电泳

注：（1）10×loading buffer中仅有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)一种染料（浓度0.05%）；

（2）6×loading buffer中含色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯青蓝FF（Xylene Cyanol FF)两种染料（浓度都是0.05%）

在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中溴酚蓝（Bromophenol Blue）约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同，二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。

6×loading buffer是用来上样的；10×loading buffer是stop buffer，是停止酶促反应的，如果一定要用10×loading buffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10×loading buffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右）。

(3) 5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法

组份浓度：

250mM Tris-HCl（pH6.8）

10%（W/V） SDS

0.5%（W/V） BPB

50%（V/V） 甘油

5%（W/V） β-巯基乙醇

配制量： 5mL

配制方法：

1.量取下列试剂，置于10mL塑料离心管中。

1M Tris-HCl 1.25mL

SDS（ 十二烷基硫酸钠 ） 0.5g

BPB（溴酚蓝） 25mg

甘油 2.5mL

2.加入去离子水溶解后定容至5mL。

3.小份（500μl/份）分装后，于室温保存。

4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。

5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右

16S 核糖体RNA

1.简介

16S 核糖体RNA（16S ribosomal RNA，或简称为 16S rRNA）是[1] 分。16S rRNA的长度约为1,542 nt。一个细菌的细胞中可包含多种具有不同序列的16S rRNA

已知16S rRNA具有如下几项功能：

16S rRNA具有与原核生物核糖体大亚基中的23S rRNA相似的结构决定功能，可作为核糖体蛋白质结合的架构。在足量Mg2+存在下分离到的16S rRNA处于紧密状态，其空间结构与30S 亚基的大小和形状十分相似。

16S rRNA的3'端含有能与mRNA上游AUG起始密码子通过氢键结合的反夏因-达尔加诺序列。另有发现表明，16S rRNA中1,505－1,539的CCUCC序列与mRNA的相应序列有互补关系。

16S rRNA能通过氢键与23S rRNA结合，增强原核生物70S 核糖体一大一小两个亚基（50S 亚基与30S 亚基）结合时的稳定性。

16S rRNA能通过其1,492及1,493的腺嘌呤残基（参见嘌呤分子结构图解）的N1原子与mRNA骨架上的2'OH基团之间产生氢键，使核糖体A位密码子－反密码子的碱基互补配对稳定化。

2.通用前体

由于不同种的真细菌与古细菌间的16S rRNA基因（16S rDNA）是高度保守

的，16S rDNA常被用于对各种生物进行的系统发育学方面的研究这种运用16S rRNA对生物进行系统发育学研究的方法由卡尔·沃斯（Carl Woese）开创。另外，线粒体和叶绿体中的rRNA也都被扩增了。 在获得能提供系统发育学信息的16S rRNA分子时需要利用通用PCR引物对16S rRNA分子进行扩增。 16S rRNA序列的对比分析需要在这类“通用引物”的脱氧核糖核酸分子的辅助下完成，这类分子具有如下序列：

8UA正向：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'

519B反向：5’-GTA TTA CCG CGG CKG CTG-3'

反向：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT

这类引物因并未在近期发现的几种属于纳古菌门（Nanoarchaeota）的热液古菌中分离识别出来，也被称为准通用引物。

3.进化指征

在众多的生物大分子中，最适合于提示各类生物亲缘关系的是rRNA,尤其是16S rRNA被普遍认为是一把好的谱系的“分子尺”这是因为：

（1） rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长经历中其可能保持不变。

（2）在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物。

（3） 16S rRNA相对分子质量大小适中，便于分析。在5S rRNA、23S rRNA和16S rRNA三种分子中，5S rRNA包含120个核苷酸，虽然它也可以作为一种信息分子加以利用，但由于其信息量小应用上受到限制。23S rRNA蕴含着大量的信息，但序列测量和分析比较的工作量较大。而16S rRNA相对分子质量大小适中（约含1540个核苷酸）含有比较广泛的的生物信息量，加上rRNA在细胞中含量大（约占细胞中RNA的90%）也易于提取。

4. 16S rRNA普遍存着于真核生物和原核生物中，真核生物中其同源分子是18S rRNA。