荧光假单胞菌生防机理的研究进展

第24卷第3期2007年6月

　

生物学杂志JOURNALOFBIOLOGY

　

Vol124　No13

Jun,2007

荧光假单胞菌生防机理的研究进展

张伟琼,聂　明,肖　明

(上海师范大学生命与环境科学学院,上海　200234)

摘　要:荧光假单胞菌是植物根际促生细菌(PlantGrowthPromotingRhizobacteria,PGPR)具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。,成为植物生防控制的重要研究对象。主要论述了荧光假单胞菌对植物病害生物防治机理的研究进展关键词:荧光假单胞菌;生防机理;植物病害中图分类号:Q939.96

文献标识码:A

:()--03

　　荧光假单胞菌(P.fluorescens)[1]

rRNAI群荧光DNA同源组,生物类群,具有分布广、快、,而且许多菌株能,[2]

。其作用机制包括:抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。近年来,随着分子生物学的广泛渗入,通过对这些作用机制的遗传性状进行分析,采用遗传工程加以改良,使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。1　抗生素介导的抑制

荧光假单胞菌产生的抗生素是它们抑制植物病害的重要因素。它们产生的抗生素有1-羧基吩嗪(phenazin-e-1-carboxylicacid,PCA),藤黄绿脓菌素(pyoluteorin,Plt),吡咯菌素(pyrrolnitrin,Prn),2,4-二乙酰藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG),绿脓菌素(pyocyanin),卵菌素A(OomycinA)等。这些抗生素具有一定的专一性,能够选择性地抑制病害。表1列出了荧光假单胞菌产生的一些抗生素及其拮抗的植物病原菌。

目前的研究主要集中在PCA、Prn、Plt和DAPG这几种抗生素上。PCA为吩嗪类物质,在细胞内作为电子载体传递电子到靶细胞,增加胞内超氧化物自由基,使靶细胞中毒死亡;Prn属于氨基糖甘类抗生素,在低浓度时破坏氧化磷酸化的偶联机制,而在高浓度时阻止参与呼吸作用的黄素蛋白和细胞色素C的电子运[3]

输;Plt和DAPG为聚酮类抗生素,具有广谱抗菌活　　收稿日期:2006-11-14;修回日期:2007-04-02

。

1986年Guuterson等人首次报道克隆得到菌株P.fluorescensHV37a的抗生素基因。该菌株抗生素的合成与转录单位。afuE、afaR、afuAB、afuP有关,其中afuAB与调节相关。之后越来越多菌株合成抗生素的基因得到确定。在荧光假单胞菌Q2-78中phlACBD作为操纵子负责合成DAPG及其前体,下游基因phlE与phlACBD共转录,与DAPG的分泌和细胞抗逆性相关,phlF基因位于操纵子上游,以相反的方向转录,编码DAPG阻遏蛋白。不同菌株DAPG合成基因序列具

[4]

有较高的相似性。Dmitri等人测定了荧光假单胞菌2-79中PCA合成相关基因phzABCDEFG,其中phzC、phzD、phzE、phzF是PCA合成所必需的。phzG与PCA合成酶辅助因子相关。phzA和phzB具有高度同源性,与合成PCA的多酶复合物的稳定有关。不同荧光假

[5]

单胞菌也具有相似的基因系统合成PCA。

荧光假单胞菌通过两组分调节系统(two-compo2nentregulationsystem)应答环境信号,系统由膜连接传感激酶(membrane-boundsensorkinase)和胞质效应蛋白(cytoplasmicresponseprotein)组成,其中传感激酶起环境感受器作用,而胞质效应蛋白介导根据传感信号而变化的基因表达。荧光假单胞菌的两组分调节系统GacS/GacA中,gacS基因编码膜连接传感激酶GacS,gacA基因编码胞质效应蛋白GacA。gacS或gacA突变体丧火产生一系列抗生素的能力,从而失去对植物致病菌的抑制能力。如荧光假单胞菌Pf-5的gacS突变体丧失产生Prn、Plt、DAPG的能力,因此失去了对植物

作者简介:张伟琼(1981-),女,上海师范大学微生物分子生物学硕士研究生,主要从事微生物分子生物学研究;通讯作者:肖　明E-mail:[email protected],021-64321022。

基金项目:上海市科委重大项目(批准号:04DZl9304);上海市教委重点项目(05ZZl4)资助

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致病菌Rhizoctonlasolani的抑制能力。菌株FPT960l的gacA突变体不产生DAPG、HCN和蛋白酶,但产生

[6]

过量的噬铁素Sid。随着两组分调节系统的鉴定,能更好地提高荧光假单胞菌中抗生素的基因调控。

表1　荧光假单胞菌产生的抗生素与其所拮抗的植物病原菌

Table1AntibioficsofPseudomonasfluorescensanditsfunctionobjects

抗生素

Pyrrolnitrin,Prn

植物病原菌

RhizoctoniasolaniThielaviopsisbasicolaAlternanaspPythiumultimum

Pyoluteorin,Pit

Phenazine-1-CarboxylicAcid,PCA2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG

Pythiumultimum

GaeumannomycesgraminisRhizoctoniasolaniGaeumannomycesgraminisPythiumultimum

OomycinAPythiumultimum

　　反应控制,而GacS/GacAσD70

。(σ)因子由rpoD基因编码,PfD过量表达使Plt和DAPG产量提高,而荧光假单胞菌M18中rpoD过量表达增强了

S38

Plt和PCA的生物合成。σ(σ)因子由rpoS基因编码,在M18中rpoS失活使其合成PCA的能力显著提高,但对碳源饥饿、有机物、过氧化物和高渗透压的抗

[7]

逆性降低,不利于菌体的生长。Pf-5的丝氨酸蛋白酶Lon突变体产生过量的Plt,并对UV较为敏感。lon

H32

基因前端序列类似于E.coli热震荡σ(σ)因子的启

H

动子,因此σ因子也调节荧光假单胞菌种抗生素的产[8]

生。由此推测,荧光假单胞菌中抗生素合成的阻遏蛋白的编码基因是依赖于σ因子进行转录或者与σ因子相互竞争RNA聚合酶。

此外,抗生素的产生还受到不同生理条件的影响。Brion等发现荧光假单胞菌CHAO中DAPG及其前体

2+2+

化合物的产生受到Zn、NH4Mo及葡萄糖的刺激;Plt

2+2+

的产生受Zn、CO和甘油的刺激但受葡萄糖的抑

2+2+

制;果糖、甘露醇、Zn和NH4Mo混合物能够增加Prn的产量;DAPG产生的最适温度为12℃。Notz等还发现Fusariumoxysporum产生的镰刀菌酸能抑制CHAO

[9]

产生DAPG。2　噬铁素介导的抑制

荧光噬铁素是由荧光假单胞菌产生的胞外水溶性黄绿色素,是其特有的铁载体。19世纪70年代Altam等人首次提出荧光假单胞菌产生的噬铁素促进植物生长并抑制植物病害。1980年Kloepper等首次从荧光假单胞菌B10中分离出具有植物病害抑制能力的荧光噬铁素。

荧光噬铁素抑制植物病害的作用机理是在低铁环10

境下荧光假单胞菌产生与铁离子有极高亲和力的荧光噬铁素,形成铁-噬铁素复合物。产生菌通过膜外专一性受体利用复合物,而其它机体不能利用。因此荧光假单胞菌通过分泌噬铁素从环境中结合铁离子为自身所利用,限制植物根际有害细菌和真菌的生长,防止真菌孢子萌发。

铁-噬铁素复合物的摄取是由专一性膜外受体所介导的。1986年Buyer等首次提出荧光假单胞菌具有多种受体摄取不同的铁-噬铁素复合物。他们发现菌株B10不仅能够利用菌株A214,而B10A214,E.蛋白在细胞外膜转运中介导膜内外,是E.coil所有铁—噬铁素复合物运输系统中所必须的。荧光假单胞菌358的受体序列具有与TonB蛋白结合位点同源的区域,因此在荧光假单胞菌中复合物也许也通过同样的方法穿过细胞膜。大多细

3+

菌包括荧光假单胞菌具有Fe还原酶,噬铁素与二价金属的亲和力极小,因此认为复合物与受体结合进入细胞之后铁离子通过还原机制从噬铁素中释放出来。

现已发现的荧光假单胞菌噬铁素有脓青素(pyoverdine)、假单胞菌素(pseodobactin)、绿脓菌螯铁蛋白(pyochelin)、水杨酸(SA)等。噬铁索的产生受到

2+

许多因素的影响,如Co、果糖、甘露醇、葡萄糖和甘油均能增加荧光假单胞菌CHAO中绿脓菌螯铁蛋白(pyochelin)的产量。3　根部定殖

事实上,荧光假单胞菌所有的疾病抑制机制只有在它们成功地在根际定殖后才能真正起作用。杨合同等人以荧光假单胞菌P32处理小麦种子,发现菌株能在幼根表面形成一层均匀的保护层;而没有防病作用的菌株不产生保护层,说明荧光假单胞菌在根部定殖时保护了病原菌的侵染位点,降低侵染机会,是防病的关键因素之一。

不同的荧光假单胞菌在不同的根际有不同的定殖能力。有报道表明一株荧光假单胞菌定殖于土豆根际时,在砂质土壤的定殖速度是粘土的10倍,而另一株则在砂质土壤的定殖能力高于泥炭土壤。虽然这表明土壤的结构直接影响了菌株在根际的定殖,但其它与土壤类型相关的间接因素如湿度、温度、pH值等也是根部定殖不同的原因。

其他生物体的存在也影响根际定殖,如蛭弧菌属是土壤中革兰氏阴性菌的专性寄生菌,Scherff等发现它们影响大豆根际中荧光假单胞菌的存活。Daniel等发现土壤中存在大量噬菌体作用于不同的荧光假单胞

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菌,这些噬菌体对细胞的溶解也影响荧光假单胞菌的定殖。当某一特殊噬菌体存在时敏感菌株的定殖能力下降,而抗性菌株不受影响。4　其它机制4.1　次生抗性代谢物

荧光假单胞菌还产生许多其它具有抗性的次生代谢物,与植物病原菌具有拮抗作用。如许多荧光假单胞菌产生的HCN能影响植物的病原菌。M.Nagarajkumar等发现荧光假单胞菌PfMDU2产生乙二酸,对植物病原菌产生的草酸具有解毒作用,能够抗由Rhizoctoniasolani

[10]

引起的水稻疾病。Nielsen等发现荧光假单胞菌96.578产环形脂肽,对病原菌Rhizoctoniasolini有拮抗作[11]

用;在沙质土壤中甜菜的根际发现大量荧光假单胞菌产循环脂肽CLPs(约60%),这些CLPs均表现出极强的生物表面活性剂特性,[12]

物病原菌。、酶、真菌细胞壁,W36株真菌的生长。4.2　一些荧光假单胞菌在根部的定殖能诱导植物对病原菌产生系统抗性(InducedSystemicResistance,ISR),水杨酸的积累被认为是重要因素,而脂多糖和噬铁素也是重要的诱导物质。诱导抗性的可能机制是产生抗微生物的低分子量化学物质,如植物保护素、双萜、多

[13]

聚物、木质素等并诱导一些水解酶和氧化酶。Van等人用P.fluorcescensWSC417处理康乃馨花,再接种镰刀萎蔫病病原菌,明显提高了康乃馨的植物保卫素水平。已发现一些生长旺盛的植物其内生的荧光假单

[14]

胞菌的数量特别高,这也许与内生荧光假单胞菌诱导系统抗性作用有关。4.3　基因工程构建

随着基因工程的发展,更多的特性被引入荧光假单胞菌,使其能更有效地抗植物病原菌。1986年Obukowicz等将Bacillusthuringiensis的δ内毒素插入一株荧光假单胞菌的染色体,使重组菌株能够抑制某些昆虫。Fuchs等将Serratiamarcescens甲壳酶编码基因克隆到荧光假单胞菌并表达。在国内,丁之铨等人将Bt杀虫基因导入荧光假单胞菌P3O3,工程菌IPP202不仅在拮抗性方面没有减弱,并且还具有杀虫作用。5　问题与展望

荧光假单胞菌作为植物根际促生细菌对多种植物病害具有防治作用,但在应用上仍有许多问题。荧光假单胞菌的防治效果一般为50%～60%,需通过优良菌株的筛选提高效率。次生代谢物抑制病害的具体机制并未完全搞清,是否还有其他作用机制尚无定论。基因研究表明在改进这些菌株生防控制能力及多样性

上还有极大的潜能,然而将基因修饰有机体(GMOs)释放到环境中却存在不可预测的风险。因此这些都还有待科学工作者的进一步研究。

参考文献:

[1]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学

出版社,2002.162～166.[2]李怀波,彭　珺,包　衍,等.拮抗油菜菌核病菌的荧光假单胞杆菌的分离与筛选[J].中国农学通报.2005,21:334～337.[3]金　颖,胡洪波,张雪洪.假单胞菌产生的抗生素研究

[J].上海农业学报,2005,21:106[4]周洪友,魏海雷,刘西莉,等.2,4

能[].,.

M,RobertFB,etal.ASeven-gene

lofphenazine-1-carboxylicacidbymonasfluorescens2-79[J].J.Bateriol.1998,180(9):254l～2548.

[6]ZhangLiqun,YangQian,TosaYukio.etal.Involvementof

gacAgeneinthesuppressionoftomatobacterialwiltbyPseudomonasflourescensFPT960[J].GenPlantPathol,2001,67:134～143.

[7]徐汪节,朱栋华,等.荧光假单胞菌M18的rpoS基因克隆及其功能分析[J].微生物学报.2004,44(3):309～314.[8]CherylAW,VirginiaOS,JoyceEL,etal.Lonproteasein2

fluencesantibioticproductionandUVtoleranceofPseudo2monasfluourescensPf-5[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(7):2718～2725.

[9]NotzR,MaurhoferM,DubachH,etal.Fusaricacid-produ2

cingstrainsofFusariumoxysporumalter2,4-diacetrlphlo2roglucinolbiosyntheticgeneexpressioninPseudomonasfluo2rescensCHAOinvitroandintherhizosphereofwheat[J].ApplEnvironMicrobiol.2002,68(5):2229～2235.[10]NagarajKM,JayarajJ,MuthukrishnanS,etal.Detoxifica2

tionofoxalicacidbyPeudomonasfluorescensstrainPfM2DU2:implicationsforthebiologicalcontrolofricesheathblightcausedbyRhizoctoniasolani[J].MicrobiologicalRe2search,2005,160:291～298.

[11]NielsenTH,ThraneC,ChristophersenC,etal.Viscosi2

namide,anewcyclicdepsipeptidewithsurfactantandanti2fungalpropertiesproducedbyPseudomonasfluorescensDR54[J].JApplMicrobiol,2000,89:992～1001.[12]NielsenTH,SoresenD,TobiaeenC,etal.Antibioticand

biosurfactantpropertiesofcycliclipopeptidesproducedbyflourescensPseudomonasspp.formthesugarbeerphizos2phere[J].ApplEnvironMicrobiol,2002,68:3416～3423.[13]杨海莲,孙晓璐,宋　未.植物根际促生细菌和内生细菌的诱导抗病性的研究进展[J].植物病理学报,2000,30:106～110.

[14]邹文欣,谭任详.植物内生菌研究新进展[J].植物学

(下转24页)报,2001,43(9):881～892.

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B,2000,355,473～489.

　

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决,我们可以根据旋转分子马达的运动机制发展出一些新的设计思想,如制造纳米级的生物器件,更加有效的利用能源等等,利用分子马达在微观层次上的特有的功能为人类服务。

参考文献:

[1]GeorgeOster,HongyunWang.Reverseengineeringapro2

tein:themechanochemistryofATPsynthase[J].BiochimBiophysActa,2002,1458(2-3):482～510.

[2]韩英荣,旋转分子马达的代表———ATP合成酶[J],现代

[5]GeorgeOster,HongyunWang.Whyisthemechanicaleff2

ciencyofF1-ATPasesohigh[J].JournalofBioenergeticsandBiomembranes,2000,32(5):459～469.

[6]WUWei-xia,ZHANYong,ZHAOTong-jun,etal.Direct2

edmotionofamolecularmotorbasedonthefour-statemodelwithunequalsubstepsCommun[J].TheorPhys,2003,40(1)9～14.

[7]Jiangpeng,MaJP,etal.Adynamicanalysisoftherotation

mechanisminF1-ATPase[J].2002,10:921～931.

[8]YQ,,p-basedmod2

ofATPbyF1-ATPase[～205,

物理知识,2003,3:7～10.

[3]翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M],北京:高等教

育出版社,2000,219.

[4]K.KinositaJrandothers.Arotarymolecularmotorthatworkatnear100%efficiency[J].PhilRSoc′srotationcatalysis

stochastictransitiondynamics

ZHENGYan,ZHANYong,HANYing-rong,

111

YANGMing-jian,LIChen-pu,YUKun

(1.SchoolofScience,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300103,China;2.PhysicsDepartment,HandanNormalUniversity,Hebei056005,China)

Abstract:TheATPpasessynthesizeATPusingatransmembraneionmotiveforceestablishedbyelectrochemi2calgradientorrevrsetoperformasionpumpusingthehydrolysisenergyofATP.ithasveryhighefficiencyofener2gytransformation,nearly100%.Inthispaper,baesdonthestructureoftheATPaseandthemasterequation,asto2chastichoppingmodelwhichdescribestherotaryfour-statemotorl′sdynamicsactionwasused.Therelationshipofdriftωelocity,diffusioncoefficientandtheATP′sconcentrationwasobtained.Resultwhichaccordswiththerotarymotor’sbiologicalmechanismwasfound.

Keywords:ATPase;four-statemodel;masterequation;biophysics

(上接11页)

1,2

1

1

Advancesinbiocontrolmechanism

ofPseudomonasfluorescens

ZHANGWei-qiong,NIEMing,XIAOMing

(CollegeofLifeandEnvironmentSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China)Abstract:Pseudomonasfluorescensareplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR),whichareubiquitoussoilmicroorganismsandcommoninhabitantsoftherhizosphere.Theyareimportanttobiologicalcontrolofplant.Itsmechanismincludesproductionofseconderymetablitesandeffectiverootcolonization.TheprogressofbiocontrolmechanismofPseudomonasfluorescenswasdiscussed.

Keywords:Pseudomonasfluorescens;biocontrolmechanism;plantdisease24