骨碎补总黄酮的提取.含量测定及抗氧化活性研究

摘要

本论文以骨碎补为原料采用乙醇加热回流的方法制备骨碎补黄酮粗提物；利用紫外分光光度法测定提取物中总黄酮的含量。通过单因素实验和正交实验确立骨碎补总黄酮提取的最佳工艺条件。对骨碎补中总黄酮的抗氧化性、羟自由基(·OH)的清除能力进行了研究。采用邻苯三酚自氧化测定和邻菲罗啉法测定羟自由基(·OH)的清除能力。结果：骨碎补中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1:30、浸提时间3h 、浸提温度60℃。骨碎补中黄酮类化合物具有抗氧化活性性，且对·OH、O 2-·的清除在一定条件下随着提取液的浓度增大而增加。

关键词骨碎补黄酮提取含量测定抗氧化活性

Extraction , content determination and antioxidant activity of Tittle:Tittle:ExtractionExtraction,

total flavonoids in the Drynaria

Abstact

This thesis is about preparing Rhizoma Drynariae flavone extracts by ethanol refluxing method, using Rhizoma Drynariae as raw materials. We used UV spectro -photometric method to determin e total flavone content in the extract. Through the single factor experiments and the orthogonal experiments, we established the total flavonoids of Rhizoma Drynariae ethanol extraction. We studied the antioxidant flavonoids and scavenging capacity of hydroxyl free radical(·OH).Pyrogallol autoxidation and 1,10-phenanthroline monohydrate method were used to determine the scavenging capacity of it. Results:the optimum technological conditions for ethanol concentration of the Rhizoma Drynariae extracting flavonoids was 60%,solid-liquid ratio was 1:30,extraction time was 3h extraction temperature was 60℃. Rhizoma Drynariae in flavonoid compounds had antioxidant activity, and the removal activities of ·OHand O 2-·was increasing with the extract concentration under certain conditions.

:Drynaria, Flavonoids, Extract, Determination of content, Antioxidant Keywords Keywords:

activity

目录

第1章绪论 ...................................................................................................................... 1

1.1骨碎补概况............................................................................................................. 1

1.1.2植物属性........................................................................................................ 1

1. 植物形态............................................................................................................... 1

1.1.3中药属性........................................................................................................ 2

1.1.4骨碎补现代研究............................................................................................ 2

1.2黄酮类化合物研究进展.......................................................................................... 3

1.2.1黄酮类化合物介绍........................................................................................ 3

1.2.2黄酮类化合物的提取工艺............................................................................ 7

1.2.3黄酮类化合物的纯化和分离...................................................................... 10

1.2.4黄酮类化合物的含量测定方法.................................................................. 12

1.2.5黄酮类化合物的检测和结构鉴定.............................................................. 12

1.3总黄酮的抗氧化性研究........................................................................................ 12

1.4本论文研究的目的、意义及内容........................................................................ 13

第2章骨碎补黄酮的提取、含量测定及抗氧化性研究................................................ 14

2.1材料、仪器及试剂................................................................................................ 14

2.2骨碎补中总黄酮的提取........................................................................................ 15

2.2.1提取工艺的选择.......................................................................................... 15

2.2.2实验部分...................................................................................................... 15

2.3骨碎补中总黄酮含量测定.................................................................................... 15

2.3.1提前准备工作：实验用标准溶液的配制.................................................. 16

2.3.2波长的选择.................................................................................................. 16

2.3.3亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠用量对吸光度A 的影响......................... 16

2.3.4标准曲线制作.............................................................................................. 18

2.3.5骨碎补黄酮提取物的测定.......................................................................... 19

2.4骨碎补中总黄酮的提取工艺研究........................................................................ 19

2.4.1乙醇浓度对提取率的影响.......................................................................... 19

2.4.2浸提温度对提取率的影响.......................................................................... 19

2.4.3料液比对提取率的影响.............................................................................. 19

2.4.4浸提时间对提取率的影响.......................................................................... 20

2.4.5正交试验确定提取的最佳条件.................................................................. 20

2.5骨碎补中总黄酮的抗氧化性研究........................................................................ 20

2.5.1溶液的配制.................................................................................................. 20

2.5.2黄酮类物质抗氧化性测定.......................................................................... 21

第3章实验结果与分析.................................................................................................... 22

3.1含量测定............................................................................................................... 22

3.1.1芦丁标准曲线............................................................................................ 22

3.1.2含量测定结果............................................................................................ 23

3.2单因素实验结果................................................................................................... 23

3.2.1乙醇浓度对提取率的影响........................................................................ 23

3.2.2提取温度对提取率的影响........................................................................ 24

3.2.3料液比对提取率的影响............................................................................ 25

3.2.4提取温度对提取率的影响........................................................................ 26

3.3正交试验结果....................................................................................................... 26

3.4黄酮扛氧化活性研究结果分析........................................................................... 28

3.4.1黄酮类化合物清除O2-·自由基能力的实验结果.................................. 28

3.4.2黄酮类物质清除·OH能力的实验结果.................................................... 28

第4章总结与展望............................................................................................................ 29

4.1研究结论................................................................................................................ 294.2创新之处................................................................................................................ 30

4.3个人建议................................................................................................................ 30

4.4研究展望................................................................................................................ 30致谢.................................................................................................................................... 31

参考文献.............................................................................................................................. 32

第1章绪论

1.1骨碎补概况

1.1.1骨碎补简介

骨碎补Oats(Avenasativa) ，如图1所示，为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm. 的干燥根茎。全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或再燎去茸毛（鳞片）。本品呈扁平长条状，多弯曲，有分枝，长5～15cm ，宽1～1.5cm ，厚0.2～0.5cm 。表面密被深棕色至暗棕色的小鳞片，柔软如毛，经火燎者呈棕褐色或暗褐色，两侧及上表面均具凸起或凹下的圆形叶痕，少数有叶柄残基及须根残留。体轻，质脆，

易折断，断面红棕色，维管束呈黄色点状，排列成环。无臭，味淡，微涩。

图1骨碎补

1.1.2植物属性

1. 植物形态

(1)槲蕨，又名崖姜、岩连姜、爬岩姜、肉碎补、石碎补、飞天鼠等。附生草本，高20～40厘米。附生于树上、山林石壁上或墙上。分布浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖北、四川、贵州、云南等地。

(2)中华槲蕨，附生草本，高20～40厘米。生于高山地带的石上或树上。分布青海、甘肃、陕西、四川、云南等地。

(3)石莲姜槲蕨，又名近邻槲蕨。附生多年生草本，高达60厘米。附生山区树干或岩石上，分布四川、云南、贵州和广西。

(4)崖姜，附生多年生草本，高60～150厘米。附生于雨林或季雨林中的岩石或

树干上。分布广东、广西，台湾和云南。

(5)大叶骨碎补，又名：硬骨碎补、华南骨碎补。多年生草本，高达1米。附生于岩石或树干上。分布广东、广西、台湾、云南。

(6)海州骨碎补，多年生草本，高15～20厘米。附生于石山。分布辽宁、山东、江苏、浙江和台湾。

2. 采集：冬、舂采挖，除去叶片及泥砂，晒干或蒸熟后晒干，用火燎去毛茸。

1.1.3中药属性1. 生药材理化鉴别：

薄层色谱：取本品粉0.5g ，加甲醇5mL 冷浸过夜，滤过，滤液作供试液；另取柚皮甙作对照品，分别点样于同一聚酰胺薄膜上，以苯-甲醇-丁酮（3:1:1）展开，用1%三氯化铁乙醇液喷雾。供试品色谱中，在与对照品色谱的相应位置上，显同样的色斑。

2. 含量测定：照高效液相色谱法测定。

3. 功能主治：补肾强骨，续伤止痛。用于肾虚腰痛，耳鸣耳聋，牙齿松动，跌扑闪挫，筋骨折伤；外治斑秃，白癜风。

1.1.4骨碎补现代研究

1. 药理作用

(1)据中国药科大学周铜水等研究，槲蕨根茎水煎剂(20g/kg，30g/kg)及柚皮甙(相当原药20g/kg) 灌胃对实验性大鼠骨损伤愈合有促进作用。

(2)骨碎补水煎剂7.5-50g/kg灌胃，对大鼠实验性关节炎具有刺激骨关节软骨细胞代偿性增生作用，并能部分改善由于力学应力线改变造成关节软骨的退行性变，从而降低骨关节病变率。

(3)骨碎补双氢黄酮甙能增加体外培养大白鼠乳鼠心肌细胞的搏动频率，使收缩有力，并对心肌细胞有起搏作用，其作用机理，可能类似一种β-受体激动剂。

(4)骨碎补水煎液(100%)0.8mL/kg口服，对实验性高血脂兔可明显预防血清胆甾醇、甘油三酯的上升，并能防止主动脉壁粥样硬化斑块的形成。

(5)豚鼠实验提示，骨碎补煎剂与卡那霉素合用可减轻卡那霉素对耳蜗的毒性作用，但不能控制停药后中毒性耳聋的发展。

(6)骨碎补煎剂在试管内能抑制葡萄球菌的生长。

2. 临床应用

(1)防治链霉素毒性及过敏反应

(2)治疗鸡眼

1.2黄酮类化合物研究进展

1.2.1黄酮类化合物介绍

1.2.1.1黄酮类化合物简介2'

7

6

544' C 6' 15' A B 3

图22-苯基色原酮

黄酮类化合物又称黄碱素或黄酮体，多显黄色。是以2-苯基色原酮（图2）为母核而衍生的一系列天然化合物。黄酮类物质在自然界分布极广，在植物体中通常与糖结合成苷类，也有以游离形式（苷元）存在的。天然黄酮类化合物母核上常连接有酚羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等。

根据2、3、4号碳的氧化程度、是否成环、B 环与C 环的连接位置，黄酮类物质分为以下几种：黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮（又称黄烷酮）、二氢黄酮醇（又称黄烷酮醇）、二氢异黄酮（又称异黄烷酮）、查耳酮、二氢查耳酮、橙酮、黄烷、黄烷醇、黄烷二醇（3,4）（又称白花色苷元）。

黄酮类物质中有药用价值的很多，如芦丁能防治老年高血压和脑溢血，降血脂和胆固醇。从银杏叶中提取制成的舒血宁片中含有黄酮和双黄酮类，可用于治疗冠心病、心绞痛等。心脉舒通（立可定）是一种人工全合成的黄酮，有扩张冠状血管、增加冠脉血流量的作用。此外，许多的黄酮类物质具有止咳、祛痰、平喘、护肝，解毒、抗菌等生理活性。

1.2.1.2黄酮类化合物的分类及化学结构类型

黄酮类化合物的基本母核结构见表1。

黄酮类化合物少数游离，大部分与糖基结合成糖苷。糖基多数连在C-8或C-6的位置上，连接的单糖（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等），双糖（槐糖、龙胆二糖、芸香糖等），三糖（龙胆三糖、槐三糖等，酰化糖有2-乙酰葡萄糖、吗啡酰葡萄糖等）。

天然黄酮类物质除大多数为O-苷外，很少以C-苷的形式存在（如葛根素）。

1.2.1.3黄酮类化合物的理化性质及颜色反应

1. 理化性质

黄酮类物质多数为结晶性固体，少数呈无定型粉末状。黄酮泪化合物的颜色多呈灰黄、黄色、橙黄色，少数不显色（不存在共轭体系或共轭很少，如二氢黄酮、二氢

黄酮醇、异黄酮类等）。花色素及其苷元的颜色，随pH 的变化而不同，一般pH8.5时呈现蓝色，而两者之间则显紫色。

黄酮苷元一般难溶或不溶于水，但易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，也易溶于稀碱液。黄酮类物质的羟基糖苷化后，在无机溶剂中的溶解度相应增大，而脂溶性则相应减少。天然黄酮类物质多以苷类的形式存在，并且与糖的种类、数量、联接位置及方式各不相同。联接黄酮苷的糖类有单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷一般易溶于强有机极性溶剂（如水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等），但难溶于弱极性有机溶剂（如苯、乙醚、三氯甲烷等）。联接的糖链越长则越易溶于无机溶剂。因黄酮类物质的分子中含多个酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。酸性的强弱与酚羟基数目、位置有关。某些黄酮类化合物在紫外灯光（254nm 或者365nm ）下而呈现不同颜色的荧光，用氨蒸汽或碳酸钠溶液处理后荧光表现更为明显。多数黄酮类化合物可与铝盐、镁盐或铅盐等生成有色的金属络合物，这可用于检测黄酮类化合物的存在。

2. 颜色反应

由于分子中常存在酚轻基和γ－吡喃环，黄酮类化合物与某些试剂反应而会显色，常见的显色反应如表2：表2黄酮类化合物的颜色反应（*表示有荧光）

类别

盐酸+镁粉黄酮黄→红黄酮醇红→紫

红

盐酸+锌粉

硼氢化钠

硼酸-柠檬

酸

醋酸镁

三氯化铝

氢氧化钠

水溶液

浓硫酸黄→橙*黄→橙*黄*黄黄黄*黄绿深黄蓝*蓝绿黄*黄黄*黄黄—淡黄红→紫红红—绿黄紫红—绿黄*紫红蓝→紫红———黄——————二氢黄酮红、紫、蓝查尔酮—异黄酮—橙酮—黄→橙（冷）橙→红深红→(热)橙→紫橙、紫黄红、洋红

1.2.1.4黄酮类化合物的药理活性

(1)心血管系统活性

黄酮类物质能够改善血液循环，降低胆固醇含量，这些功能能够预防和改善心脑血管疾病。研究发现芦丁、葛根素及人工合成的立可定（recordil ）等均有明显的扩冠

作用。槲皮素、芦丁、金丝桃苷、葛根素、灯盏花素、银杏叶等中提取出的黄酮有保护缺血性脑损伤的作用；金丝桃苷、水飞蓟素、木犀草素、沙棘黄酮也有助于治疗心肌缺血性损伤；银杏叶黄酮、葛根黄酮、大豆苷元等可对心肌缺氧性损伤起一定的保护作用。此外，沙棘黄酮、苦参黄酮或甘草素等还具有调节心律失常的功能。

(2)抗菌及抗病毒活性

黄酮类化合物有一定的抗菌及抗病毒活性，如木犀草素、黄岑苷和黄岑黄酮有一定的抗菌作用；槲皮素、二氢槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；而从菊花、獐牙菜中提取得到的黄酮单体、大豆苷元、染料木素、鸡豆黄素A 对HIV 病毒有一定的抑制作用。

(3)抗肿瘤活性

黄酮类化合物的抗肿瘤机制有很多种，如槲皮素通过自身的抗氧化作用来抑制相关酶的活性、降低癌变细胞耐药性及雌激素样作用而诱导癌变细胞凋亡；水飞蓟素则通过抗氧化功能来抑制相关酶同时诱导细胞周期阻滞。

(4)抗氧化自由基活性

大多数黄酮类物质都能够有效清除氧自由基，是一种很强的抗氧剂。黄酮类物质的有些药理活性（如抗衰老、抗癌）也往往与其抗氧化自由基相关。

(5)抗炎、镇痛活性

芦丁、羟基芦丁、二氢槲皮素等对5-HT 及PGE 诱发的小鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有显著的抑制作用；从金荞麦中提取出的黄酮也有抗炎、解热、祛痰功能；金丝桃苷、芦丁、槲皮素及银杏叶黄酮也有比较好的镇痛活性。

(6)保肝活性

水飞蓟素能够治疗中毒性肝损伤、急慢性肝炎、肝硬化等有疾病；淫羊藿黄酮、黄岑素、黄岑苷能够抑制肝组织脂质过氧化、提高肝脏SOD 活性、减少肝组织脂褐素形成，对肝脏有保护作用；甘草黄酮可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤等。

1.2.2黄酮类化合物的提取工艺

天然药用植物中的黄酮类化合物的种类多，并且具有多种生物活性的多酚类化合物，而在植物体内的不同部位，有不同状态的结合（如在花果叶中大多数以甙为存在形式，而在花果的木质部以甙元为主要形式存在），黄酮的种类不同具有不同的性质，所以黄酮类物质的提取，主要根据被提物植物中化合物的理化性质和杂质的类型来选择不同的提取剂，较大极性的苷元和甙类，一般常用极性较大的混合物，例如水-甲醇、乙醇-水混合进行提取。大部分的甙元比较适合用较小极性的溶剂来提取，如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等来作为提取剂来提取，而多甲氧基黄酮类甙元也可用苯来提取。

1.2.2.1有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是目前国内外使用最广泛的提取方法，且便于实现产业化。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等溶剂，较高体积浓度的醇(如95%)适于提取苷元(在糖苷类化合物中，与糖缩合的非糖部分)，体积浓度为60%左右的醇常用于提取苷类(苷类（glycosides ）又称糖配体，是糖类物质与另一类非糖物质通过糖的端基碳原子连接而形成的化合物。苷元部分几乎包括各种类型的天然化合物。根据苷元的结构类型可分为酚苷、氰苷、醇苷、蒽苷、黄酮苷、皂苷、强心苷（能治疗心脏病）、香豆素苷和环烯醚萜苷等)。提取时提取的次数一般是2～4次。较小极性的游离黄酮苷元，常用乙酸乙酯、氯仿、甲醇或甲醇-水等提取；而较大极性的黄酮苷元，可用甲醇、甲醇-水、乙醇-水等提取。多糖黄酮苷，因为极性比较大，甚至可直接水提；高甲氧基黄酮化合物，极性比较低，直接用苯提取也行。

如惠寿年等[1]用乙醇作为提取剂提取细穗柳中黄酮，结果40%乙醇提取效果最好。刘青利等[2]在对比热水浸提、70%乙醇提取、碱提取和60%丙酮-水溶液提取，发现以60%丙酮作溶剂，提取率最高。

王在贵等[3]采用乙醇热提取法提取茶叶中的黄酮，并通过正交试验确定了总黄酮提取的最佳工艺为：提取时间1h ，提取温度80℃，乙醇浓度70%，固液比1:20(g/mL）。

张颖心等[4]采用乙醇浸取法提取毛竹叶中的总黄酮，通过单因素实验确定提取工艺：30％的乙醇溶液，60℃，固液比l:10，浸取时间为l h 。

刘健伟等[5]采用乙醇热提取法提取骨碎补中的总黄酮，提取工艺条件：65%的乙醇溶液，提取3次，提取时间每次1.5h ，固液比1:10。

蔡建，王薇[6]采用乙醇提取法提取桂花黄酮类化合物，通过正交试验确定了总黄酮的最佳提取工艺条件：乙醇浓度80%、浸提温度70℃、料液比1:40、浸提时间3h 。

钟秋平，林美芳[7]采用浸提法提取黄皮果中的总黄酮，通过不同浓度的乙醇溶液和不同浓度的甲醇溶液浸提后，测定浸提液中总黄酮的含量，最终确定95%的甲醇溶液为最佳浸提液。

周晓丽等[8]采用乙醇热回流提取法提取木瓜中的总黄酮，通过单因子和正交实验优化提取过程中的料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间，得到最佳的提取条件为:料液比1:6，乙醇浓度70%，90℃回流3h 。

薄南南，傅桦[9]采用常规提取法，超声提取法和微波提取法对玉米须中所含的黄酮类化合物进行提取，确定最佳提取工艺条件：在80℃的高温下进行，且提取时间为3.5h 。

用有机溶剂提取法提取黄酮时，在提取的过程中，若选择的有机溶剂为乙醇，选择合适的乙醇浓度对黄酮的提取相当重要，一般来说降低乙醇浓度不利于黄酮类化合

物的提取。但是这还与黄酮类化合物的结构也有部分关联，高浓度的乙醇溶液适用于黄酮苷元类的提取，低浓度乙醇溶液适用于多甲氧基的甙类的提取。

1.2.2.2水提取法

热水提取法仅适用于黄酮甙类化合物的提取（比如从愧花米中提取芦丁），该方法成本低、对环境及人类无毒害、设备简单，适合工业化生产，但提取率比较低，而且提取物中杂质较多（如蛋白质、无机盐、糖类等等）。这是因为蛋白质、鞣质、淀粉、多糖等水溶性杂质易溶于水，热水浸提时会同时被提取出来，后处理比较复杂，所以这种方法不是很常用。毛燕等[10]用此法提取喜树翅果黄酮。该法操作简单，针对性强。

1.2.2.3碱提酸沉法

黄酮类化合物多具有酚轻基，易溶于碱水，因此可用碱性水（碳酸钠、氢氧化钠水溶液）或碱性稀醇(50%的甲醇溶液) 浸出，浸出液酸化后即可析出黄酮类化合物。但碱水提取时碱液浓度不能过高，因为强碱在加热条件下可能会破坏某些黄酮类化合物的母核。目前主要使用的碱性溶液是石灰水(Ca(OH)2水溶液) 和稀氢氧化钠水溶液。

使用石灰水的优点是使植物材料中较多的羟基的鞣质、粘液质、果胶等杂质形成不溶的钙盐而沉淀出来，这有利于浸出液的纯化(例如芦丁的提取) 。缺点是浸出效果不如稀氢氧化钠水溶液好，且某些黄酮类化合物本身也能与钙离子结合形成沉淀，而被滤除。

稀氢氧化钠溶液的浸出率比较大，但同时浸出的杂质较多，不便于纯化。查文献得出，5%NaOH-稀乙醇溶浸出率较高，但酸化后析出的黄酮类化合物在稀醇溶液中有一定的溶解液，会导致产品的提取率降低。

由于此法简便易行，因此芦丁、橙皮苷的提取都用该方法。如从菊花中提取黄酮类化合物时，用pH 值为10的稀NaOH 溶液浸出效果好[11]。而从槐米中提取芦丁时，则用石灰水作溶剂，有利于芦丁成盐溶解，效果好[12]。

1.2.2.4超声波法

超声波法的原理是利用超声波的空化作用加速对植物细胞膜的破坏，从而有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波不断震荡提取液，有助于溶质的扩散。因此，超声波提取法能显著缩短提取的时间，并且提高黄酮提取率。应奇才等[13]在提取苦丁茶中黄酮类化合物时，发现超声波振荡辅助丙酮提取效果好。

例如，水芹中提取黄酮类化合物时，在40倍于样重的80%乙醇中浸泡，然后用超声波辅助浸提30min ，连续提取两次，黄酮类化合物的浸出率高达94.6%，而用相同浓度的乙醇溶液提取总黄酮的浸出率仅有73%[14]。采用超声波法对黄芩甙成分的提取工艺[15]进行了研究（与水煎煮法对比），结果表明，超声波法明显缩短了提取的时间，且黄芩苷提取率大大提高。超声波提取10～100min 的提取率均高于水煎煮法提取3h 。应用超声波法对槐米中芦丁的提取工艺[16]进行研究，结果表明：槐米超声波提取30min 所得提取率比热碱法高47.56%，且工艺简单、方便快速。超声波法是提取植物中黄酮苷类化合物的一种非常有效的方法。

1.2.2.5微波萃取法

首次利用微波萃取法提取天然化合物是Ganzler 等人，由于其微博萃取法的提取率高、成本低、副产物少、节省原料且对环境无毒害等优点，微波技术在提取、分离领域存在潜在的巨大优越性。在国外，微波萃取法早已广泛应用于食品、中草药成分的提取，且常常与质谱、气相、液相等分析方法联用作为一种新型的检测手段。

麦军利，杨莉兵等[17]用微波萃取法提取雪莲粉末中的黄酮类化合物，功率128W ，提取时间15min ，提高了雪莲的利用率，节省了原料。

1.2.2.6酶解法

对于某些天然药物，黄酮类物质被以纤维素为主的细胞壁包围不易溶出，故可以采用酶解法溶解细胞壁从而使黄酮类物质溶出。如山楂中，由于黄酮类化合物部分被细胞壁包围，且这些细胞壁间尚有细胞间的果胶粘结，因此酶法提取率比目前常用的方法高。张红侠等[18]用复合酶（果胶酶、纤维素酶）酶解山楂叶，提取率比常用的方法（水提取和乙醇提取法）相比提高了2%～3%。

总之，黄酮类化合物的提取方法大致有以上几种，各有不同。根据目标提取物的理化性质、工艺设备、提取成本等提取条件来优化最佳提取工艺，从而提高黄酮类化合物的提取率。

1.2.3黄酮类化合物的纯化和分离

1.2.3.1硅胶吸附柱色谱

硅胶内部有很多微孔，具有很大的表面积，在硅胶颗粒内部及分子之间形成的分子间力是对称的，无相互作用，但固体表面的分子所受的力是不均匀的，故在硅胶表

面就存在表面吸附力。故黄酮类物质与硅胶有较强的吸附能力，很难洗脱。黄酮类化合物与硅胶中的金属离子络合而不能够被洗脱，所以应先用浓盐酸处理除去硅胶内的金属离子，以免干扰分离的效果。在特定条件下，硅胶能与被分离物质之间产生氢键、范德华力等分子间力，在相同情况下，吸附和脱附同时进行，吸附质用适当的流动相洗脱可以被解吸下来。

硅胶主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮(醇) 和高度甲基化或乙酰化的黄酮和黄酮醇，如用乙醚-氯仿溶剂系统从野靛中分离异黄酮类。硅胶在降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物，如甙类、多羟基黄酮类化合物。

1.2.3.2聚酰胺吸附柱色谱

聚酰胺分子中存在很多的酰胺基，其吸附机理是聚酰胺内的酰胺键与酚羟基、硝基、-OH 等形成氢键，因而对多羟基物质（如酚类、醌类）产生吸附作用，形成氢键的能力不同，吸附力也就不同。形成氢键的能力：水大于有机溶剂。聚酰胺柱的流动相分两大类：非极性溶剂系统和水溶剂系统。用水溶剂作为极性流动相时，机理与反相色谱相似，可以用于分离萜类、甾类、生物碱类等，这些天然产物很难与聚酰胺形成氢键。另一类是用非极性流动相洗脱，机理相似于正相色谱。在含水的流动相中，一般规律为：

（1）分离物与聚酰胺形成的氢键基团越多，相应的吸附力越大。

（2）氢键位置对吸附力有影响（对位酚羟基>间位酚羟基>邻位酚羟基）。

（3）羟基若能参与形成共轭π键，则吸附力增大。

（4）分子内的氢键越多，吸附力越弱。

聚酰胺柱层析是分离黄酮类化合物及多酚类化合物很有效[19]。由于对鞣质的吸附性非常强，且不可逆，因此可用来除去鞣质。

1.2.3.3大孔吸附树脂柱色谱

大孔吸附树脂是一类有机高聚物，主要以苯乙烯型或2-甲基丙烯酸酯型为主，是以吸附和筛选相结合的一种大网格吸附剂，具有硅胶柱色谱和葡聚糖凝胶柱色谱的功能。其吸附原理为形成分子间力或氢键，而筛选作用由于树脂本身具有多孔结构。若要用于极性化合物的分离，必须选择有极性的树脂，树脂制备方法为：合成时引入极性基团（如酰胺基、酚羟基等）。大孔树脂内部结构为三维空间立体孔状，白色球状颗粒，粒度20～60目。颗粒内部由于呈网孔状，因此比表面积很大，吸附能力强，具有良好的筛选吸附性能。

1.2.4黄酮类化合物的含量测定方法

天然药用植物中黄酮类化合物的定量检测方法主要有：HPLC 法[20-24]、可见分光光度法(铝盐显色) [25-26]、薄层层析法[27-28]和紫外分光光度法等。

1.2.5黄酮类化合物的检测和结构鉴定

通常可采用黄酮类物质的特征颜色反应和荧光反应对黄酮类化合物进行定性检测。紫外分光光度法可用来进行定量检测。高效液相色谱法(HPLC)是目前天然产物化学中应用尤为广泛的一种检测方法，其中反向液相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色。黄酮类物质的分析中C 18柱用的最为普遍，过去主要分析极性较大的苷或苷元，现在也可用于分析极性较小的苷元。应用反向HPLC 分析黄酮类物质，一般优先选择的流动相为甲醇-水或乙腈-水体系。为了提高分离度常常需要梯度洗脱。

1.3总黄酮的抗氧化性研究

黄酮是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花色素、花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E 的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。

李志洲[29]采用烘箱储藏法测定抗氧化性，采用H 2O 2/Fe 2+体系法测定样品对·OH的清除作用；采用AP-TEMED 体系法测定样品对O 2-·清除作用。

周晓丽[8]利用体外实验检测不同浓度木瓜中总黄酮对DPPH·的清除作用来研究总黄酮的抗氧化性。

王立[30]采用乌饭树树叶中黄酮类色素对超氧阴离子自由基[O2-·]的清除实验来研究黄酮的抗氧化性。

孙锋，张宽朝[31]对其抗氧化性、羟自由基(·OH)的清除能力和过氧化值(POV)进行了研究。采用邻苯三酚自氧化测定抗氧化性；用新鲜猪油测定过氧化值(POV)。

赵爱云等[32]通过研究山楂水溶性黄酮对葵花籽油的抗氧化性，效果与0.001%TBHQ相当。

孟志芬等[33]通过以新鲜猪油为底物，通过测定POV 值来研究毛泡桐总黄酮的抗氧化活性。

影响黄酮类化合物抗氧化活性的因素，最主要的是羟基化的程度和羟基位置。一般来说，B 环中的邻二羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用。黄酮类化合物于O 2-·、-OH 的反应相当于一个连锁反应在终结阶段的反应，在消除O 2-·、-OH 的反应中起着氢供体的作用，使具有高度氧化活性的自由基还原，从而达到消除的目的。

1.4本论文研究的目的、意义及内容

黄酮类化合物是一类植物中分布很广泛的低分子量天然多酚类天然产物，几乎存在于所有的绿色植物中，具有多种明显的药理活性。目前国内外对骨碎补黄酮的研究报道不多，而从骨碎补中提取黄酮的相关研究更是寥寥无几。

为了综合利用骨碎补资源，尤其是在食品和天然药物领域的应用，本课题对骨碎补黄酮的提取、含量测定、抗氧化活性进行一部分探索性基础研究，为进一步开发骨碎补作为天然创新药物提供理论基础，具有重要的经济和社会意义。本论文的主要研究内容如下:

（1）采用乙醇提取的方法，从骨碎补中提取黄酮，确立一种合理的实验室小试工艺流程，并初步测定其黄酮的含量。

（2）通过单因素实验和正交试验设计确立骨碎补黄酮的乙醇提取的最佳工艺条件。

（3）通过减少自由基的产生和清除自由基这两方面研究总黄酮的抗氧化性。

第2章骨碎补黄酮的提取、含量测定及抗氧化性研究

2.1材料、仪器及试剂

材料：骨碎补(来自吉林大药房) ，

仪器：见表3。表3实验所用仪器及生产厂家

仪器

高速万能粉碎机

数控超声波清洗器

精密电子天平

紫外可见分光光度计

数显恒温水浴设备

旋转蒸发仪

冰箱电热恒温鼓风干燥箱

冷冻离心机

试剂：见表4。

表4实验所用试剂及生产厂家

试剂

芦丁对照品

无水乙醇

95%乙醇

亚硝酸钠

三氯化铝(结晶)

氢氧化钠分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯

型号生产厂家北京中兴伟业仪器有限公司昆山市超声仪器有限公司上海天平仪器厂上海棱光技术有限公司金城国胜实验仪器厂巩义市予华仪器有限责任公司海尔集团上海博迅实业有限公司医疗设备厂北京医用离心机厂FW-100KQ-300DE 型FA1004UV-754N HH RE-5299FCD-258S GZX-9246MBE LGR10-4.2型级别生产厂家天津一方科技有限公司北京化工厂天津市富宇精细化工有限公司国药集团化学试剂有限公司天津化学试剂厂上海试剂四厂

聚酰胺（柱层析用）

浓盐酸

锌粉

浓硫酸

浓氨水

邻苯三酚30-60目分析纯浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂北京化工厂上海金锦乐实业有限公司分析纯分析纯分析纯北京化工厂北京化工厂北京化工厂

2.2骨碎补中总黄酮的提取

2.2.1提取工艺的选择

用有机溶剂提取法提取黄酮时，在提取的过程中，若选择的有机溶剂为乙醇，选择合适的乙醇浓度对黄酮的提取相当重要。黄酮提取的工艺中，80%以上研究者选择乙醇为溶剂提取，鉴于乙醇浸提提取的提取率高等优点以及以上有关文献报道，本实验选择大多数研究人员的方法即乙醇热回流提取法。

2.2.2实验部分

称取骨碎补种子500g ，用万能粉碎机粉碎后，过40目筛，用石油醚脱脂18h ，待石油醚挥发后待用。

准确称取研磨打碎后的脱脂骨碎补2.500g ，按1:25料液比加入50mL70%(体积分数) 乙醇，70℃加热回流60min 。过滤，滤渣同样条件提取，反复提取3次，合并三次得到的滤液共150mL ，通过旋转蒸发仪减压回收乙醇，浓缩至100mL ，得骨碎补总黄酮粗提取物的待测液。

取2mL 提取液，加入4滴浓盐酸，再加入少量的锌粉，在水浴锅（60℃）中加热3~4分钟，观察颜色变化。上层有紫红色变化，结果表明提取液中有黄酮类化合物存在。

2.3骨碎补中总黄酮含量测定

黄酮类化合物的含量测定是依据黄酮母核中某些位置的羟基与Al 3+发生络合反应形成的络合物来进行测定。由于所选择的反应条件不同(有的利用黄酮类化合物直接与Al 3+反应，有的在醋酸-醋酸盐溶液反应) ，形成络合物的最大吸收也不同。在

NaNO 2-Al(NO3) 3-NaOH 反应体系中以芦丁为标准测定骨碎补中总黄酮的含量。

2.3.1提前准备工作：实验用标准溶液的配制

(1)芦丁标准液：准确称量芦丁标准品0.0020g ，于50mL 烧杯中，加入甲醇适量，微热，使之溶解，加入60%乙醇水溶液(体积分数) 定容至50mL ，摇匀后置于冰箱中保存，此时芦丁浓度为40μg/mL。

(2)5%NaNO2溶液：准确称量2.500g 无水NaNO 2于50mL 烧杯中，加25mL 蒸馏水溶解转移至50mL 容量瓶，定容至刻度后，置于低温避光保存。

(3)10%Al(NO3) 3溶液：准确称取5.000g Al(NO3) 3`6H 2O 于50mL 烧杯中，加25mL 蒸馏水溶解后转移至50mL 容量瓶中，定容至刻度。

(4)4%NaOH 溶液：准确称取4.000gNaOH 晶体于50mL 烧杯中，加25mL 蒸馏水溶解后转移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，转移至塑料瓶保存。

(5)70%乙醇水溶液(体积分数) ：准确量取蒸馏水300mL ，然后加入无水乙醇700mL ，摇匀，转移至1000mL 容量瓶，备用。

2.3.2波长的选择

精确量取1.0mL 芦丁对照品溶液，按照标准曲线绘制的方法，在323~600nm 内扫描，得到总黄酮与铝盐配合物的吸收光谱图[34]。从检测结果来看，总黄酮与铝盐配合物在323nm 、389nm 、510nm 处有较大吸收。而510nm 波长处其它成分的干扰小，故选择500nm 为测定波长。

2.3.3亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠用量对吸光度A 的影响

在NaNO 2-Al(NO 3) 3-NaOH 反应体系中以芦丁为标准液测定骨碎补中总黄酮的含量。芦丁的显色反应是一个络合反应，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠的用量应与芦丁的浓度有关，其加入量应使显色反应的吸光度最大。

(1)亚硝酸钠用量对吸光度的影响

分别量取1mL 的芦丁标准液于6个(标号为1，2，3，4，5，6) 10mL 的容量瓶中，分别按顺序加入0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mL 的5%的NaNO 2溶液，摇匀，放置10min 。加10%Al(NO3) 3溶液0.25mL ，摇匀，放置10min ，加4%NaOH 溶液4mL ，然后用70%的乙醇定容，摇匀，放置10min 。分别在510nm 处测吸收度，得吸光度和亚硝酸钠溶液的浓度变化曲线，如图3。

吸光度A

亚硝酸钠用量(mL)

图3亚硝酸钠用量与吸光度A 的关系曲线

(2)硝酸铝用量对吸光度的影响

分别量取1mL 的芦丁标准液于6个(标号为1，2，3，4，5，6）10mL 的容量瓶中, 分别加5%的NaNO 2溶液0. 25mL ，摇匀，放置10min ，按标号顺序依次加入0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mL 的10%的Al(NO3) 3溶液，摇匀，放置10min 。加4%NaOH 溶液4mL ，然后用70%的乙醇定容，摇匀，放置10min 。分别在510nm 处测吸收度，得吸光度和Al(NO3) 3的用量变化曲线，如图4。

吸光度A

硝酸铝用量 (mL)

图4硝酸铝用量与吸光度A 的关系曲线

3）氢氧化钠用量对吸光度的影响

分别量取1mL 的芦丁标准液于6个(标号为1，2，3，4，5，6) 10mL 的容量瓶中，分别按顺序加入0. 25mL 的5%的NaNO 2溶液，摇匀，放置10min ，加10%Al(NO3) 3溶液0. 25mL ，摇匀，放置10min ，然后按顺序加入1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL 的4%NaOH 溶液，然后用70%的乙醇定容，摇匀，放置10min 。分别在510nm 处测吸收度，得吸光度和氢氧化钠浓度的变化曲线。

1.2

1.1

吸光度A

1.0

0.9

0.8

0.7

NaOH用量 (mL)

图5氢氧化钠用量与吸光度A 关系曲线

由图3，4，5可见：当NaNO 2用量0.25mL 、Al(NO3) 3用量0.25mL 、氢氧化钠的用量4mL 时，体系的吸光度达到最大值。所以，芦丁为标准测定黄酮浓度时亚硝酸钠加入量为0.25mL ，硝酸铝加入量为0. 25mL ，氢氧化钠加入量为4mL 。2.3.4标准曲线制作

准确移取芦丁标准溶液2mL ，3mL ，4mL ，5mL ，6mL ，7mL 于25mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.25mL ，10min 后，加入10%Al(NO3) 3溶液0.25mL ，摇匀，再加入4%NaOH溶液4mL ，70%乙醇定容至刻度。于510nm 处测量其吸光度；参比溶液：加入5%NaNO2溶液0.25mL ，10min 后，加入10%AlCl3溶液0.25mL ，摇匀，再加入4%NaOH溶液4mL ，70%乙醇定容至刻度。测定吸光度A 。

表5芦丁标准液浓度与吸光度A

芦丁标准液浓度(μg/mL)吸光度

0.28

0.4

0.56

0.7

0.84

0.94

3.2

4.8

6.4

8

9.6

11.2

2.3.5骨碎补黄酮提取物的测定

取骨碎补黄酮提取物的待测液1mL 3份分别于10mL 容量瓶中，加入5%NaNO 2

溶液0.25mL ，摇匀，静置10min ，加入10%A1C13溶液0.25mL ，再加入4%NaOH 溶液4mL, 70%乙醇（V/V）定容至刻度，静置10min ，于波长510nm 处，以蒸馏水为空白对照，测定其吸光度。

2.4骨碎补中总黄酮的提取工艺研究

在提取过程中,很多因素影响黄酮的提取率，主要是料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间,利用单因子实验观察它们对黄酮提取率的影响。2.4.1乙醇浓度对提取率的影响

分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液热回流在60℃下提取相同量的脱脂骨碎补样品，并测定提取率。2.4.2浸提温度对提取率的影响

称取质量为2.000g 的脱脂骨碎补样品，用70%的乙醇溶液分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取2h ，并测定提取率。

2.4.3料液比对提取率的影响

用70%的乙醇溶液，在60℃条件下热提取2h ，对不同的料液比进行提取试验，料液比(g/mL)分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60和1:70，浸提时间为2h ，测定提取率。

2.4.4浸提时间对提取率的影响

在料液比1:30、乙醇溶液70%的条件下，每隔0.5h 计算一次提取液中的提取率。

2.4.5正交试验确定提取的最佳条件

为了全面考查影响因素，设计了4因素3水平的正交试验，试验因素水平见表6。

表6正交实验因素水平表L 9(34)

因素

水平123

乙醇浓度（%）料液比（g/mL)

A 607080

B 1:201:301:40

提取时间（h ）提取温度（℃）

C 123

D 506070

2.5骨碎补中总黄酮的抗氧化性研究

总黄酮的抗氧化活性研究有多种，而黄酮对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 的清除作用和黄酮对自由基的清除作用（样品对·OH的清除作用，黄酮对H 2O 2/Fe 2+体系通过Fenton 反应产生的·OH都具有清除作用和样品对O 2-·清除作用，黄酮对AP-TEMED 体系产生的O 2-·）是最常用的研究黄酮抗氧化活性的方法。

对于黄酮类物质抗氧化活性研究，80%以上研究者选择测定提取物的过氧化值（POV ）来研究其抗氧化活性，鉴于该方法反应时间短、能清楚地计算抑制率等优点以及以上有关文献报道，本实验选择大多数研究人员的方法即黄酮类化合物对超氧阴离子自由基(O2-·)的抑制率。2.5.1溶液的配制

0.05mol/LTris-HCl缓冲液（PH=8.2）的配制：50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris ）溶液与22.9mL 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL 。

邻苯三酚(7mmol/L)溶液的配制：称取邻苯三酚0.882g ，用10mmol/LHCl 溶液溶解，定容至10mL ，避光保存。

HCl （10.0mmol/L）溶液的配制：用小量筒去浓盐酸0.8mL ，加水至1000mL 混匀即可。

硫酸亚铁（9mmol/L）溶液的配制：称取0.1368g 硫酸亚铁粉末于100mL 容量瓶中定容，避光保存备用。

水杨酸（9mmol/L）溶液的配制：准确称取水杨酸0.1242g 于100mL 容量瓶

中定容，备用。

双氧水（8.8mmol/L）溶液的配制：用量筒量取20mL 于100mL 容量瓶中定容，备用。

2.5.2黄酮类物质抗氧化性测定

2.5.2.1黄酮类化合物清除O 2-·自由基能力的测定1). 邻苯三酚氧化速率的测定

取4.5mL 50mmol/LTris—HCI缓冲溶液【35】(pH=8.2)，4.1mL 蒸馏水混匀后在25℃水浴中保温20min ，分别加入0.5mL 的不同浓度的黄酮样品液，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3mL ，迅速摇匀后倒人比色杯，420nm 下测定吸光度A i 。以蒸馏水为空白作为对照，测定吸光度A 0。2). 清除率的计算：清除率（%）=(A 0-A i )/A 0×100%

式中：A 0为未加黄酮粗提取液的空白实验的吸光度，

A i 为加入不同浓度黄酮粗提取液的吸光度。

2.5.2.2黄酮类物质清除·OH能力的测定（邻菲罗啉法）

Fenton 反应是生物体内产生·OH的主要反应，其反应方程式为：Fe 2+﹢H 2O 2→Fe3+﹢OHˉ﹢·OH

用比色法测定Fenton 反应产生的·OH，其中邻菲罗啉-Fe 2+是该反应的一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐的反映溶液氧化还原状态的改变，如果向反应加入·OH清除剂，则·OH减少，同时Fe 3+增多，溶液颜色变红，由此可推算·OH清除剂对·OH的清除效率。1)A 0的测定

在25mL 容量瓶中一次加入9mmol/LFeSO 4，9mmol/L水杨酸各2mL ，加2mL 8.8mmol/LH 2O 2启动反应1h ，用蒸馏水定容，静置，于510nm 处测定吸光度A 0。2)A i 的测定

在5个25mL 容量瓶中一次加入9mmol/LFeSO 4，9mmol/L水杨酸各2mL ，不同浓度的黄酮粗提取溶液1mL ，加入2mL 8.8mmol/LH 2O 2启动反应1h ，用蒸馏水定容，静置，于510nm 处测定吸光度A i 。

清除率（%）=(A 0-A i )/A 0×100%其中：A 0为空白实验的吸光度；

A i 为不同浓度反应液的吸光度。

第3章实验结果与分析

3.1含量测定

3.1.1芦丁标准曲线

根据表5中的数据，以吸光度(A)为纵坐标，以芦丁标准液浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，如下图6：

图6芦丁标准液浓度与吸光度A 的关系曲线

根据图6中的关系曲线可知：

提取中黄酮的浓度=（测得的吸光度A －0.0080）/0.0850提取得到黄酮的质量=提取液中黄酮的浓度×提取液的体积提取率=提取得到黄酮的质量/骨碎补的质量×100%3.1.2含量测定结果

将测得的吸光度，代入回归方程计算总黄酮含量，结果见表7：表7骨碎补黄酮提取物的测定结果

序号12吸光度1.01171.0121待测液浓度(μg/mL)12.40112.406平均浓度(μg/mL)

3

1.011812.403

12.403

则骨碎补黄酮提取率=3.31%。

3.2单因素实验结果

3.2.1乙醇浓度对提取率的影响

将测得的吸光度代入回归方程，计算得到提取率，结果见表8，以提取率为纵坐标，乙醇浓度为横坐标绘制曲线，见图7。

表8乙醇浓度对提取率的影响

乙醇浓度（%)提取率(%)

403.089

503.105

603.281

703.278

803.274

903.265

提取率 (%)

40

50

60

70

80

90

乙醇浓度 (%)

图7乙醇浓度（%）与提取率（%）的关系曲线

由表8，图7可知：在温度为70℃、固液比为1:30、提取时间2h 的条件下，比较不同乙醇浓度对提取率的影响，结果显示，随着乙醇浓度的增加，提取率升高。当浓度大于60％时，提取率的有所降低。所以，骨碎补中总黄酮提取的最佳乙醇浓度是60％。

3.2.2提取温度对提取率的影响

将测得的吸光度代入回归方程，计算得到提取率，结果见表9，以提取率为纵坐标，提取温度为横坐标绘制曲线，见图8。

表9提取温度对提取率的影响

提取温度（℃）提取率（%）

2.832

2.852

3.483

3.381

3.307

3.298

40

50

60

70

80

90

提取率 (%)

40

50

60

70

80

90

提取温度 (℃)

图8提取温度（℃）与提取率（%）关系曲线

从表8，图8可知：40℃到60℃提取率有较大的增长, 但60℃到90℃提取率减小。而60℃时总黄酮含量最大。这主要是由于黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，同时由于温度的升高，浸提液黏度减少，扩散系数增加，促进浸提速度加快。但温度太高可能使黄酮发生氧化，并且增加能耗，故选择温度60℃作为考虑对象。

3.2.3料液比对提取率的影响

将测得的吸光度代入回归方程，计算得到提取率，结果见表10，以提取率为纵坐标，料液比为横坐标绘制曲线，见图9。

表10料液比对提取率率的影响

料液比（g/mL）提取率（%）

1:203.162

1:303.246

1:403.247

1:503.248

1:603.248

1:703.249

提取率(%)

1:20

1:30

1:40

1:50

1:60

1:70

料液比(g/mL)

图9料液比（g/mL）与提取率（%）的关系曲线

从表10，图9可知：随着料液比的提高，提取率上升，但超过1:30后上升趋势不明显，由于溶剂用量过大, 不仅增加了溶剂用量, 也增加了浓缩回收溶剂的能耗，且增加了对环境的污染。因此从提取工艺角度出发，我们选择料液比1:30以下作为考虑对象。

3.2.4提取温度对提取率的影响

将测得的吸光度代入回归方程，计算得到提取率，结果见表11，以提取率为纵坐标，提取温度为横坐标绘制曲线，见图10。

表11提取时间对提取率的影响

提取时间（h ）提取率（%）

2.572

3.054

3.158

3.178

3.268

3.198

1

1.5

2

2.5

3

3.5

提取率 (%)

提取时间 (h)

图10提取时间（h ）与提取率（%）的关系曲线

由表10，图10结果表明：当提取时间为3h 时，提取效果最好。当时间继续延长时，提取率反而降低。这可能是浸提时间太长，有部分乙醇被挥发而导致沸点逐渐增大，从而破坏某些黄酮类化合物。同时考虑到实际生产应用中的生产周期和生产成本，故选用3h 为宜。3.3正交试验结果

表12正交实验结果

因素

实验号

123456789K 1K 2

A 1112223339.5468.729

B 1231231238.5299.193

总黄酮含量

C 1232313128.0478.379

D 1233122317.8709.283

（%）2.6323.4353.4792.8283.1222.7793.0692.6362.116

K 3

k1

k2

k37.8213.1822.9102.607

0.5758.3742.8433.0642.7910.2739.6702.6822.7933.2230.5418.9432.6233.0942.9810.471R

比较表12中4因素的R 值的大小，可以看出A 因素，即乙醇浓度为最重要因素；其次为C 因素，即提取时间；再其次为D 因素，即浸提温度；而B 因素，即料液比为不重要因素。同时乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度四因素对黄酮提取量影响的主次顺序为乙醇浓度>浸提时间>浸提温度>料液比，并且最好的提取条件为乙醇浓度60%、料液比1:30、浸提时间3h 、浸提温度60℃，即A 1B 2C 3D 2。

3.4黄酮扛氧化活性研究结果分析

3.4.1黄酮类化合物清除O2-·自由基能力的实验结果

清除率 (%) 0.00.20.40.60.81.0

浓度 (mg/mL)

图11浓度（mg/mL）与清除率（%）的关系曲线

由图11结果表明：在实验浓度范围内，骨碎补中黄酮类化合物对清除O ﹣2·自由基有一定的量效关系，骨碎补中黄酮类化合物在一定浓度范围内清除效果随黄酮浓度的增加而加强。

3.4.2黄酮类物质清除·OH能力的实验结果

清除率 (%) 浓度 (mg/mL)

图12浓度（mg/mL）与清除率（%）的关系曲线

由图12结果表明：在实验浓度范围内，骨碎补中黄酮类化合物对清除·OH自由基有一定的量效关系，骨碎补中黄酮类化合物在一定浓度范围内清除效果随黄酮浓度的增加而加强。

第4章总结与展望

4.1研究结论

本实验的主要实验结果和研究结论如下:

（1）骨碎补的热回流提取总黄酮的工艺条件：料液比（g/mL）为1:25，提取时间3h ，提取温度70℃，乙醇浓度70%。

（2）采用乙醇热回流提取法，从骨碎补中提取总黄酮，采用紫外分光光度法测得骨碎补总黄酮的含量为3.31%。

（3）在单因素试验基础上，通过正交设计试验，研究结果得到各因素对骨碎补总黄酮提取率指标影响的主次顺序为:A ＞C ＞D ＞B ，即依次为乙醇浓度、浸提时间、浸提温度、料液比，其中乙醇浓度对骨碎补总黄酮提取率影响最大。本研究表明最佳条件为A 1B 2C 3D 2，即提取乙醇浓度60%、料液比1:30、浸提时间3h 、浸提温度60℃。

（4）骨碎补中总黄酮抗氧化活性研究的方法：黄酮类化合物对自由基的清除能力。结果：骨碎补中黄酮类化合物在一定浓度范围内清除O 2-·、·OH效果都随黄酮浓度的增加而加强。

4.2创新之处

虽然国内外从植物中提取黄酮类化合物的研究已成为热点，但研究者从骨碎补中提取黄酮甚少。而对骨碎补中提取的总黄酮抗氧化活性研究更寥寥无几。

4.3个人建议

鉴于本论文的相关实验结果和结论，结合实验过程中出现的问题，个人就本实验提取以下建议:

在小试放大时，可以用40倍量的石油醚在提取前浸泡骨碎补原料进行脱脂，避免提取后脱脂对黄酮的损失。同时也可以考虑用60%乙醇为提取液提取黄酮，避免浪费试剂。

可以将黄酮粗提取液纯化后测定黄酮的抗氧化性，避免其他杂质的干扰。

4.4研究展望

（1）进一步采用大孔吸附树脂柱色谱技术分离骨碎补中总黄酮，并得到单体，鉴定其结构。

（2）在精制骨碎补黄酮的基础上，研究其抗癌、抗菌、保肝、预防和治疗心脑血管疾病等生理活性，为开发骨碎补黄酮类药物和保健品提供理论依据和技术支撑。

致谢

本文是在指导老师李桂娟教授的亲切关怀和细心指导下完成的。李老师学风严谨、知识渊博，在选择论文课题、研究思路、实验方案、论文设计等方面都给予了我必要的指导和帮助，使我受益匪浅，成为我不断思索、研究的源泉与航标。在此，谨向尊敬的李桂娟老师致以诚挚的谢意！感谢李老师长期以来给我的无微不至的关心、教诲和鼓励。希望在以后的人生道路上继续得到恩师的更多指点。在这里衷心的祝愿李老师身体健康，家庭幸福，事业有成，笑口常开！

真挚的感谢张龙、程凤梅、程桂茹、刘湧涛、冼远芳等制药工程专业的老师在实验中给予的诸多便利与帮助。真诚的祝愿化学工程学院制药工程专业的所有老师工作顺利，阖家欢乐！

感谢李老师带的所有研究生对我实验和论文修改提供的宝贵意见和帮助！尤其感谢师兄龚伟！实验期间，一直不断地支持、鼓励和帮助我，每当我试验遇到困难，无法进行时，他们总能给我提出宝贵意见，使我豁然开朗，理清思路。甚至占用自己的宝贵时间，亲自动手帮我解决问题，在此万分感谢，永远铭记于心！祝福他们永远笑得灿烂、开心！

感谢制药工程专业全体同学在实验期间对我的无私帮助。尤其是感谢素云同学！感谢所有帮助过我的人，祝你们永远幸福，快乐！

最后，对化学工程学院全体老师多年来对我的培养和支持表示诚挚的谢意。祝愿母校的明天更加灿烂辉煌，祝所有老师和同学身体健康、工作顺利。

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