二次谐波成像及其在生物医学中的应用_屈军乐

第23卷,第1期2006年1月

深圳大学学报理工版

JOURNALOFSHENZHENUNIVERSITYSCIENCEANDENGINEERING

Vol.23,No.1Jan.2006

文章编号:1000-2618(2006)01-0001-09

二次谐波成像及其在生物医学中的应用

屈军乐,陈丹妮,杨建军,许改霞,林子扬,刘立新,牛憨笨

(1.深圳大学光电子学研究所,深圳518060;2.南开大学现代光学研究所,天津300071)

1

1

2

1

1

1

1

摘　要:二次谐波成像是近年发展起来的一种三维光学成像技术,具有非线性光学成像所特有的高空

间分辨率和高成像深度,可避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应,是一种理想的非侵入生物活体成像方法.生物组织的病变往往会引起微观结构的变化,而二次谐波信号对组织的结构对称性变化高度敏感,因此二次谐波成像对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测,具有很好的生物医学应用前景.介绍二次谐波成像的发展现状,生物组织中二次谐波信号的产生机理,二次谐波成像的实现手段及其在生物医学领域的应用.

关键词:二次谐波;非线性光学;生物组织;显微成像;早期诊断;高分辨率;活体成像中图分类号:O43;Q6　　　　文献标识码:A

射效应最小,激发光能深入组织内部,相比传统的

引　言

1961年红宝石激光器发明不久,Franken等人用红宝石激光器输出波长为694nm激光穿过一个石英晶体时,产生347nm的紫外光

[1]

显微镜,如激光扫描共焦显微镜,可以做更深层的成像.例如,Shi-WeiChu等人用二次谐波和三次谐波显微成像观察斑马鱼1.5mm的体内晶胚的发育过程

[2]

,可清楚地观察到从最初的细胞分芽繁殖

.这是最早到原肠胚的形成,直到组织的形成,而不需要对样品进行任何处理.此外,二次谐波成像技术的发射与激发波长相距较远,因此信号易于有效分离.

对活体生物样品,SHG还具有一些独特的优点.SHG一般为非共振过程,光子在生物样品中只发生非线性散射,不被吸收,因此不产生伴随的光化学过程,可减小对生物样品的损伤.实验结果表明,采用1230nm激发光观察斑马鱼受精卵时,虽然激发光的平均功率高达100mW,且经过12h连

续观察,注入受精卵的能量超过了1kJ,但受精卵并未受到光损伤,仍然保持细胞活性

[2]

观察到的光学二次谐波(secondharmonicgenera-tion,SHG)现象,标志着非线性光学的诞生.从此,SHG被用于倍频激光器以得到短波长激光.近年随着激光技术、检测技术和计算机技术的快速发展,利用二次谐波进行生物组织的三维成像成为生物医学成像领域中的热门课题.引起广泛关注.

SHG是一个二阶非线性过程,二次谐波成像具有与双光子激发荧光(two-photonexcitedfluores-cence,TPEF)显微成像类似的特性.如SHG和TPEF的激发效率与激发光的平方成正比,因此仅在焦点附近才有足够的光子能量来激发,非线性效应的强局域性减少了成像时非焦点处发光产生的背景干扰,提高了信噪比和三维空间分辨率;同时使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低,因此能长时间对样品进行成像而不影响其活性.由于二次谐波显微成像使用近红外的激发光,组织吸收和散

.另外,在

许多情况下,组织的病变过程中的线性光学特性变化很小,传统的线性光学成像技术不能检测.生物组织发生病变时一般都会伴随着组织结构、细胞形态及分子结构的变化,SHG对组织微观结构变化高度敏感,所以有望将该方法用于某些疾病(如糖尿病、动脉硬化和一些视网膜疾病等)的早期检测和

收稿日期:2005-09-12;修回日期:2005-11-11

基金项目:国家自然科学基金项目(60408011,60138010);广东省自然科学基金资助项目(5010500);光电信息技术科学教育部重点实验

室开放基金项目(2005-5)

作者简介:屈军乐(1970-),男(汉族),陕西省西安市人,深圳大学副研究员、博士.E-mail:[email protected]

　2深圳大学学报理工版第23卷

诊断.二次谐波显微成像技术不需进行样品染色,因此对某些不能进行荧光标记的样品,采用二次谐波显微成像技术检测有效.

波产生.

SHG的一个主要条件是需要没有反演对称的介质.当电偶极子近似时,在中心对称的样品中产生的电极化强度方向相反且大小相等,因此相互抵消,二阶电极化率张量为零,即没有SHG.

SHG还必须满足相位匹配条件.如果满足完全相位匹配条件,则传播中的倍频光波和不断产生的倍频极化波间保持了相位的一致性,相互干涉,产生的二次谐波振幅由零开始,至基波的功率全转变为二次谐波的功率,最终二次谐波的输出最大.此外,SHG还与样品的非线性光学系数deff有关,deff越大越能有效产生二次谐波.deff大的介质,满足相位匹配条件时,能有效产生二次谐波.二次谐波的相干性使二次谐波信号的角度分布高度结构化,且与激发光的空间分布和介质空间结构密切相关

[5]

1　SHG原理

介质在强激光作用下,电极化强度与入射辐射的场强E间的关系可表示为

(1)

(2)

2

(1)

[3]

(3)

3

P=εχE+χE+…)0(χE+(1)

(2)

其中,χ是一阶电极化率或线性电极化率;χ、(3)(2)2χ为二阶、三阶非线性电极化率张量.ε0χE正是SHG和TPEF等二阶非线性光学效应的根源.假设入射光的场强为E1cos(ωt+ ),由式(1)可知,入射光产生的二阶非线性电极化强度为1(2)21(2)2εt+ )].其中,第0χE1ε0χE1cos[2(ω22

[4]

二项为二倍频成分.即在电偶极子近似下,非中心对称分子在频率为ω的入射光场作用下,辐射光除有线性的频率成分ω外,还包含了频率为0和2ω的非线性成分.当散射介质中分子群产生的以2ω为频率的非线性散射成分相干,就称为二次谐

.当介质中散射粒子均匀分布,激发

光为准直光束时,二次谐波的分布为前向.实际上,SHG现象就是将两入射光子转换成一个出射光

子,其频率为二次谐波频率.为保证轴向的动量守恒,当两倍入射光子动量的二次谐波光子时,其方向须与入射光子前进方向一致,如图1(a)

.

图1　SHG的动量守恒图解　　　　Fig.1　MomentumconservationofSHG

　　但现在的高分辨率二次谐波显微成像使用的都是聚焦的激光光束,聚焦光束的相位不再沿着行进轴均匀分布.当光束通过焦点时,存在一个相对准直光束的轴向相位滞后(guoyshift)π,相当于有效轴向动量也相应的减少,可以写成ξkω(kω是入射光子的动量,ξ是一个小于1的因子).由轴向上动量守恒,可推断出SHG只可能分成两叶,并沿着偏离轴一定角度θ≈±arccos(ξ)的方向传播,如图

1(b).

同样,介质中的散射粒子也不总是均匀分布,分布空间频率的变化,对二次谐波传播方向造成很大影响,甚至导致二次谐波背向传播.这些现象可以用动量守恒解释.设散射粒子分布具有正弦分布

N1(z)=N1[1+sin(k2ωQz)]可等价表示为

(2)

第1期屈军乐,等:二次谐波成像及其在生物医学中的应用　3

iN1(qz)=N1δ(0)(δ(qz+Q)+2

　δ(qz-Q　

(3)

无空间分布影响时,二次谐波沿k2ω(0)传播.从式(3)可见,因散射粒子本身要产生轴向动量±Qk2ω,使两叶二次谐波又各自分成两部分.随着Q的增大,其中Qk2ω使得两叶二次谐波中的一部分逐渐向z轴汇拢,而-Qk2ω使得两叶二次谐波中的另一部分逐渐张开,参照如图1(c)(这里只给出图1(b)中的上叶k2ω受散射粒子空间分布影响时产生的传播方向变化.下叶k2ω可依此类推).由该图可见,当Q=ξ时,汇拢的部分重合,变为完全前向传播;Q=1-ξ时,张开的两部分变为互相反向,且与激发光前进方向垂直;Q=1+ξ时,张开的两部分重合,变成完全背向传播.

虽然二次谐波信号角度分布呈高度结构化,但若在整个发射角度内进行积分,仍可计算总的二次谐波辐射功率.EGeorgiou等人用760～1070nm的多个波长的激发光激发I型胶原,测量了二次谐波产生的强度,结果表明,用1024nm波长的光激发时,二次谐波的强度I512与激发光强度I1024之间存在:logI512=1.92logI1024基本吻合.

[6]

图2　SHG实验装置示意图Fig.2　ExperimentalsetupofSHG

且可在整个近红外区(700～1000nm)内连续调谐,所以是二次谐波显微成像的理想光源.激光的

重复频率对SHG也有影响,如果提高激发光的重复频率,激发光的平均功率可相应提高,二次谐波信号也得到增强.

物镜:一般情况下,二次谐波主要非轴向发射,即信号收集时必须有一个足够大的数值孔径来有效接收整个二次谐波信号.

滤光片:为保证所收集的信号为二次谐波信号,必须使用滤光片.一般采用一长波滤光片和窄带滤光片(带宽10nm)组合以过滤任何干扰信号.

信号收集系统:为尽量减少二次谐波信号在系统中的损失,提高系统的探测灵敏度,最好采用非解扫(non-descanned)的信号.信号收集系统中的主要部件是PMT探测器.首先,为收集整个二次谐波信号,需要探测器的接收面足够宽.其次,对于由可调谐Ti:蓝宝石飞秒激光器,要接收的二次谐波信号处于350～500nm波段,故可采用双碱阴极光电倍增管.由于激发光波长离探测器的响应区很远,故可有效探测二次谐波信号.

除了使用不同的滤光片外,二次谐波显微成像和双光子激发荧光显微成像在系统结构上是完全兼容的.已有人成功地将激光扫描共聚焦显微镜改造

[9]

成双光子系统,同样,也可以方便的用改造后的系统进行两者的复合成像.

[8]

的关系,与理论分析

2　SHG实验装置

SHG实验装置按二次谐波信号收集方式可分为前向和后向,图2为前向和后向二次谐波产生的实验装置示意图.以图2(a)为例:由激光器产生的角频率为ω的入射基频光,经过物镜聚焦到样品上,产生频率为2ω的二次谐波,由另一个高数值孔径的物镜收集,滤光片(一般为窄带滤光片)滤掉激发光和可能产生的荧光和其他背景光,再用探测器件(如PMT)和计算机系统进行信号的采集、存储、分析和显示.

要实现二次谐波显微成像需要对以下因素进行最优化考虑:超短脉冲激光、高数值孔径的显微物镜、高灵敏度的非解扫面探测器、准相位匹配和具有高二阶非线性的样品.

激光器:掺Ti蓝宝石飞秒激光器因具有高重复频率(80MHz)和高峰值功率,单脉冲能量低,

[7]

　4深圳大学学报理工版第23卷

3.1.1　SHG-OCT

3　二次谐波显微成像技术的发展及其在生物医学中的应用

　　虽然二次谐波现象较早为人们所观测,但其应用于生物领域还是近年来的事.1986年,Freund等人首次将SHG用于生物组织成像

[10]

近年来兴起的光学相干层析成像(opticalco-herencetomography,OCT),是一种具有高空间分辨的无损光学层析成像技术.OCT成像因为组织的

线性光学散射特性(折射率)不同可产生成像对比度,而SHG依靠组织局部的非线性光学特性(二阶非线性极化率)的不同可产生成像对比度.将这两种技术结合,便可同时提供线性光学散射特性和非线性电极化率组织的结构信息和化学信息.以胶原为例,OCT图像衬度主要来自胶原基质,而SHG图像衬度,则与胶原分子排列有关

[23]

[12,22]

,这是二次谐

波现象应用于生物领域的开始.Freund选择老鼠尾腱的胶原纤维作为样品,获得的图像分辨率大约为50mm.其后,在多种生物组织中都发现了SHG,包括角膜腱

[6]

[11]

、鼠尾肌腱

[13]

[12]

和牛的I型Achilles.

、人的皮肤等.实验表明:不同生物组织结合SHG和OCT进行生物医学成像还有几个显而易见的好处.①SHG提供了它本身特有的关于组织分子组成和对称性的信息;②疾病的早期,组织形态变化很小,增大OCT图像对比度对运用OCT进行疾病早期诊断非常重要.而产生的二次谐波信号因为与激发光强度的平方成正比,所以成像对比度比传统的OCT高;③相对简单的二次谐波成像,OCT的引入,提高了探测的灵敏度,成像深度更深.加州大学的YiJiang等人采用800nm激发光对鼠尾腱进行SHG-OCT成像,轴向分辨率达3.1μm

[12]

中的二次谐波信号强弱与组织中的胶原含量密切相关,因此可以说,生物组织产生的二次谐波,

最主要的转换源自胶原.含胶原丰富的组织包括结缔组织和肌肉组织等,它们的二次谐波信号也比较强.另外,还有一些能产生强二次谐波的生物结构是微管,如细胞分裂中纺锤体

[16]

[6,14-15]

.对于具有中心

对称性的生物结构,如果局部中心对称性的破坏也会产生二次谐波:在两中心对称介质的界面,不同物态分子的相互作用使局部微观场特性在交界面(如细胞膜)发生突变,从而产生界面二次谐波.如果将特定的分子吸附在具有中心对称性的介质上(如染剂标记),使吸附的分子和介质表面层分子相互作用而破坏局部的中心对称性,便会产生表面二次谐波.例如,将细胞用对电压敏感的膜染剂(如RH237、苯乙烯基染剂、JPW-2080等)处理后,不仅能进行细胞的二次谐波成像,且二次谐波强度能

[17-20]

很好的反映膜电压的大小.

除了动物组织外,一些含有特殊分子结构的植物组织也能产生二次谐波

[21]

.

采用SHG-OCT系统,探测光束只需要进行一

维扫描,便能进行二维层析成像.随着微光纤技术的发展,SHG-OCT技术可与光纤光学结合,实现活体的内窥镜检查.3.1.2　SHG-TPEF

同时探测组织的SHG和TPEF是研究生物样品的新方法,可提供样品在功能和结构上的互补信息

[24-25]

.

.SHG和TPEF都是二阶非线性现象,两者有相似之处,却是两种完全不同的物理现象.前者是非

(2)

线性散射,与样品的二阶非线性极化率χ(2ω)的空间分布有关.后者则要用荧光发射后的非线性吸收来解释.因此,从本质上来说,这两种成像方式是完全不同的,两者所获取的信息可以相互比较,互为印证和补充.且SHG和TPEF的激发强度与激发光的平方成正比,两种显微方法的空间分辨率相当,意味着,能够从同一装置上方便的得到这两种对照模式.实际上,除了使用不同的滤光片,这两种成像测量装置几乎完全兼容.

运用这种复合成像系统能直接展现组织形态、

目前,对二次谐波显微成像的应用,主要集中在组织或细胞的成像方面,特别是对非中心对称介质,如双折射晶体、有序界面和突变处(如细胞膜和结构蛋白序列等)的研究.

3.1　二次谐波显微成像与其他成像技术结合多种成像方法的结合,可提供样品不同侧面的信息,是目前生物医学成像领域的研究热点.二次谐波显微成像具有高空间分辨率,深成像深度,低损伤,以及对结构对称性的高度敏感性的特点,如果能与其他成像技术结合,将成为生物样品研究的有力工具.

第1期屈军乐,等:二次谐波成像及其在生物医学中的应用　5

细胞新陈代谢、疾病(例如Alzheimer's症和癌症)发展的各个阶段

[24]

3.2　组织生理学中动力学研究

二次谐波显微是对活细胞、活组织进行成像的一个理想方法.最近,有报道介绍:二次谐波显微技术运用于组织生理学中动力学研究.如检测肿瘤

[11,22]

发展状况,记录神经细胞中动作膜电压改变

[19]

.

3.1.3　SHG偏振成像

微管集合的定向排列是判断神经元活动结构和

功能的决定性诊断手段.而胶原纤维矩阵结构的变化与很多生理过程有关,例如伤口复原

[25]

[23]

、老化、等.

糖尿病及癌症.综上分析可知,生物组织的二次谐波强度与组织的组织状态和散射效率有关,即不能单纯的根据二次谐波强度来确定样品结构特点

[26]

3.2.1　SHG用于活细胞成像

因为二次谐波显微成像技术具有非线性光学显微镜的高分辨率,且SHG过程无需对细胞进行染色,不会对活细胞产生光化学毒害,也不会产生荧光漂白.因此,二次谐波显微是对活细胞成像的理想方法.但为了加强二次谐波信号,采用一些对细胞无害或低害的染剂将细胞染色是目前二次谐波活细胞成像的通行办法.最近,Andrew等尝试用SHG和TPEF随时间变化展示海胆受精卵的胞外分泌状况,取得了很好的结果.3.2.2　SHG用于肿瘤研究

由于二次谐波显微成像是一种高分辨率的光学无损层析成像方法,在癌症早期诊断中能发挥很好作用.如黏膜组织,包括子宫颈、耳、鼻、口腔及食道,其病变始于皮下几百微米,而二次谐波成像完全能达到此深度,所以不需要经过传统的切片.通过图4系统,不仅能清晰可见二维二次谐波显微图像中(hamstercheekpouchmucosaltissue)各层断面,且能观察到随着表面瘤的发展,hamster

[22]

cheekpouch不同层而的厚度和形态变化,为肿瘤分期诊断提供了科学依据

.

[3,19-20]

[29]

.但我们能通过检测二次谐波信号随着偏振

角度的变化来推断一些有用的结构信息,如偏振测量确定纤维的方向性和二次谐波确定非线性电极化率信息;通过合适的激光和信号偏振组合,可确定二阶电极化率张量χ中的各个元素,并得到样品中所有胶原纤维的排列情况和分子偶极子的组织化程度;固定入射光束的偏振方向,用偏振片来选择信号的偏振方向

[27]

(2)

,测得脂鲤鱼鳞的各向异性参

数r=0.7.利用该参数有望进行骨生成不全症等疾病的诊断.

3.1.4　多焦点二次谐波显微成像

现在的二次谐波显微成像多采用单点扫描成像,但也有一种多焦点的二次谐波显微方法,如图3.微透镜阵列盘进行分光,在样品上产生多个焦点.二次谐波信号由CCD相机收集.旋转微透镜阵列,多焦点扫描样品,就会在CCD上产生一个二次谐波显微图像.该法可提高图像获取速度和二次谐波信号的探测效率.改进后的二次谐波显微成像系统,其样品扫描速度提高到3ms/幅,可观察短时间内细胞的活动变化,这对于将二次谐波显微技术应用于活体组织的实时成像非常有利

.

[28]

图4　试验装置示意图[22]Fig.4　Experimentalsetup

而在肿瘤治疗效果的监测上,SHG同样能发挥

作用.EdwinLSteele实验室(MGH/HMS)的生物

图3　多焦点二次谐波显微成像[28]

Fig.3　SHIMofmulti-focus

工程研究小组用胶原蛋白和eGFP染色的瘤细胞进行二次谐波显微成像,清楚的观察到分别用C6001和GM6001治疗骨肉瘤时的不同效果.

　6深圳大学学报理工版第23卷

3.2.3　SHG成像用于膜电压测量

细胞膜电压的测量对理解细胞信号传递过程有重要作用.使用合适的膜染剂进行标记,通过对染剂分子的二次谐波显微成像,信号强度变化便能反映膜电压的大小.近年来,二次谐波显微成像的一个主要领域,就是发展具有高时空分辨率及高灵敏度的活细胞中横跨膜电压的光学测量方法.1993

[17]

年,OBouevitch等人证明,所加电场可强烈地调制SHG强度.1999年,PJCampagnola等人

[3]

度、高空间分辨率和对生物的低杀伤性特点,为活体测量提供了一种新方法,有望成为组织形态学和生理学研究的一个强大工具.目前,SHG在神经科学、药理学及疾病早期诊断方面的应用研究已取得一些进展.但二次谐波成像还是一门不很成熟的技术,随着研究的逐步深入,对它的应用仍然有待进一步的开发.随着微光纤技术的发展,二次谐波成像技术还可与光纤光学结合进行人体内窥镜检查,实现活体生物体内深处的组织在分子水平的成像.随着信号检测技术和计算机技术等的发展,还可运用二次谐波成像实时观察生物细胞活动.由于二次谐波显微应用于肌纤维长度的精确度已达到20nm

[30]

则

证明了SHG信号随膜电压变化.实验结果表明,激发波长为850nm时,SHG对膜电压的灵敏度为

[18]

18/100mV,而TPEF只有10/100mV.2004年,Andrew等人进一步研究了苯乙烯基染剂产生的二次谐波信号对膜电压的敏感性.实验表明,使用850～910nm的激发波长,膜染剂di-4-ANEPPS和di-4-ANEPMPOH使SHG对膜电压的敏感度高达20/100mV,且由于共振增强,使用950～970nm的激发波长时,敏感度达到40/100mV.这些研究结果进一步巩固了SHG在活细胞中膜电压的功能成像中的重要性.

最近,Cornell大学的科学家,通过使用一种低毒性的有机染剂DHPESBP,对海参神经细胞进行二次谐波显微成像(如图5),并成功实现了脑组织中的电脉冲成像

[19]

[20]

,活体未标记心脏和肌肉组织的纳米药理学

研究也将发挥很大的作用.本实验室正着手研究将

二次谐波成像、共聚焦显微成像以及双光子激发荧光成像结合,根据视网膜的分层结构和特点,采用不同方法成像,进而揭示视网膜的正常生理结构及病变部位,为视网膜疾病的早期诊断提供一种新型的具有三维高空间分辨率的手段.

可以预见,在不久的将来,二次谐波成像将成为生物医学研究和临床诊断中的有力工具.

.这对于解读大脑工作过程,参考文献:

[1]FrankenPA,HillAE,PetersCW,等.光学谐波产生

[J].物理评论快报,1961,7:118-119(英文版).[2]ChuShi-wei,ChenSzuYu,TsungHanTsai,等.非侵入

性的多次谐波显微法用于活体发育生物学研究[J].光学快报,2003,11(23):3093-3099(英文版).[3]PaulJCampagnola,MeideWei,AaronLEwis,等.用

SGH进行活细胞的高分辨非线性光学成像[J].生物物理学报,1999,77(6):3341-3349(英文版).[4]王　楚,汤俊雄.光学[M].北京:北京大学出版社.

2001.

[5]MertzJ,MoreauxL.聚焦光束激发非均匀分布介质时

的二次谐波产生[J].光学通信,2001,196:325-330

解释大脑退化疾病如Alzheimer's症等,具有巨大意

义

.

图5　用膜染剂DHPESBP标记后,神经细胞的二次谐波显微成像

[19]

(英文版).

[6]GeorgiouE,TheodossiouT,HovhannisyanV,等.用纳秒

脉冲激光,且在一个宽光谱范围内采用不同激发波长时,I型胶原中的二次和三次谐波产生[J],光学通信,2000,176:253-260(英文版).

Fig.5　SHGIofneuronstainedwithDHPESBP

结　语

二次谐波显微成像因其对微观结构的高灵敏

[7]GauderonR,LukinsPB,

(英文版).

SheppardCJR.二次谐波显

2001,32(7):691-700

微方法的最优化[J].微米,

第1期屈军乐,等:二次谐波成像及其在生物医学中的应用　7

[8]ChuShi-wei,LiuTzu-ming,SunChi-kuang,等.用重复

频率2GHz的钛:蓝宝石激光器进行实时二次谐波显微[J].光学快报,2003,11(8):933-938(英文版).[9]VolodymyrNikolenko,BoazNemet,RafaelYuste.一个双

光子和二次谐波显微镜[J].方法,2003,30(1):3-15(英文版).

[10]FreundI,DeutschM,SprecherA.结缔组织极性.鼠

尾腱中的光学二次谐波显微,交叉光束和频,以及小角度散射[J].生物物理学报,1986,50(4):693-712(英文版).

[11]MengHan,LanderZickler,GuenterGiese,等.飞秒激

光消蚀基质后角膜的二次谐波成像[J].生物医学光学学报,2004,9(4):760-766(英文版).

[12]YiJ,IvanVTomov,YiminW,等.鼠尾腱中胶原的高

分辨二次谐波光学相干层析成像[J].应用物理快报,2005,86:133901-133903(英文版).

[13]TakeshiYasui,YoshiyukiTohno,TsutomuArak.i通过

二维二次谐波偏振测定法研究人皮肤胶原方向特征[J].生物医学光学学报,2004,9(2):259-264(英文版).

[14]林幸笋,潘　琳,胡金云,等.生物活组织的背向二

次谐波成像[J],生物化学与生物物理进展,2004,31(1):83-88

[15]GuyCox,EleanorKable,AllanJones,等.用二次谐波

进行胶原的三维成像[J].结构生物学学报,2003,141(1):53-62(英文版).

[16]PaulJCampagnola,AndrewCMillard,MarkTerasaki,

等.生物组织中内结构蛋白三维高分辨率二次谐波成像[J].生物物理学报,2001,81(1):493-508(英文版).

[17]BouevitchO,LewisA,

PinevskyI,等.用非线性光学

1993,65

的方法探测膜电压[J].生物物理学报,(2):672-679(英文版).

[18]AndrewCMillard,LeiJ,AaronLewis,等.直接测量由

膜染料产生的二次谐波对电压的敏感性[J].光学快报,2003,28(14):1221-1223(英文版).

[19]DaneilADombeck,MireilleBlanchard-desce,WattW

Webb.用二次谐波显微进行动作电压的光学记录[J].神经系统科学学报,2004,24(4):999-1003(英文版).

[20]AndrewCMillard,LeiJ,Mei-deWei,等.苯乙烯基产

生的二次谐波对膜电压的敏感性[J].生物物理学报,2004,86(2):1169-1176(英文版).

[21]GuyCox,NunoMoreno,Joséfeijó.植物多聚糖的二次谐

波成像[J].生物医学光学学报,024013(英文版).

[22]YiciGuo,HowardESavage,FengLiu,等.用非侵入性

光学二次谐波层析研究表面瘤的发展[J].国家科学院学报,1999,96(19):10854-10856(英文版).[23]AlvinTYeh,BunshoKao,WoongGyuJung,等.用光

学相干层析以及多光子显微术对离体皮肤组织模型中伤口康复状况进行成像[J].生物医学光学学报,2004,9(2):248-253(英文版).

[24]WarrenRZipfel,RebeccaMWilliams,RichardChristie,

等.多光子激发荧光和二次谐波进行活组织内发射显微[J].国家科学院学报,2003,100(12):7075-7080(英文版).

[25]AikateriniZoumi,XiaoL,GhassanSKassab,等.用二

次谐波和双光子激发荧光显微进行冠状动脉显微结构成像[J].生物物理学报,2004,87(5):2778-2786(英文版).

[26]PatrickStoller,Beop-MinKim,AlexanderMRubenchik,

等.鼠尾腱偏振光学二次谐波成像[J].生物医学光学学报,2002,7(2):205-214(英文版).

[27]PaulJCampagnola,LeslieMLoew.用二次谐波显微成

像显示细胞组织及生物体中的生物分子排列[J].自然生物工艺学,2003,21(11):1356-1360(英文版).[28]科学仪器及工程实验室.用于活细胞/组织观察的多

焦点二次谐波显微[EB/OL].[2005-07-10]http:∥lasie.ap.eng.osaka-u.ac.jp/res_shg.(英文版).[29]AndrewCMillard,MarkTerasaki,LeslieMLoew.受精

过程中细胞分泌的二次谐波成像[J].生物物理学报,2005,88:L46-L48(英文版).

[30]ThierryBoulesteix,EmmanuelBeaurepaire,Martin-Pierre

Sauviat,等.用二次谐波显微方法研究非染色的活心脏肌脂肪变性:肌节长度的测量精度为20nm[J].光学快报,2004,29(17):2031-2033(英文版).

2005,

10(2):

　8

Abstract:1000-2618(2006)01-0008-EA

深圳大学学报理工版第23卷

Secondharmonicgenerationmiaging

anditsapplicationsinbiomedicine

QUJun-le,CHENDan-ni,YANGJian-jun,XUGai-xia,

111

LINZi-yang,LIULi-xin,andNIUHan-ben

　　　　　　1)InstituteofOptoelectronics

ShenzhenUniversity

Shenzhen518060P.R.China

2)InstituteofModernOptics

NankaiUniversity

Tianjin300071P.R.China

1

1

2

1

Abstract:Secondharmonicgenerationimaging(SHGI)isanemerging3-Dopticalimagingmodalityinbiomedi-cine.Becauseofitsinherentnonlinearmechanism,SHGIhastheuniqueadvantagesofhighspatialresolution,largepenetrationdepthandnon-photobleaching,andisacceptedasoneofthepromisingandnon-invasivebiomedicalima-gingmodalities.Pathologicalchangesinbiologicaltissuesusuallycausechangesintheirmicrostructure.Sincethesecondharmonicgeneration(SHG)signalishighlysensitivetothesymmetrychangeofthemicrostructure,SHGIcanbeusedfortheearlydiagnosisofdiseasesandthemonitoringofaftertreatmentinclinics.ThispaperprovidesanoverviewofSHGItechnology,signalmechanisminbiologicaltissues,andtheimplementationandapplicationsofSHGIinbiomedicine.

Keywords:secondharmonicgeneration;nonlinearopticalimaging;biologicaltissue;microscopy;earlydiagnosis;highresolution;invivo

References:

[1]FrankenPA,HillAE,PetersCW,eta.lGenerationof

opticalharmonics[J].PhysicalReviewLetter,1961,118-119.

[2]ChuShi-wei,ChenSzuYu,Tsung-HanTsai,eta.lInvivo

developmentalbiologystudyusingnoninvasivemulti-harmon-icgenerationmicroscopy[J].OpticsExpress,2003,11(23):3093-3099.

[3]PaulJCampagnola,Mei-deWei,AaronLewis,eta.lHigh-resolutionnonlinearopticalimagingoflivecellsbysecondharmonicgeneration[J].(6):3341-3349.

[4]WANGChu,TANGJun-xiong.Optics[M].Beijing:Pe-kingUniversityPress,2001(inChinese).

[5]MertzJ,MoreauxL.Second-harmonicgenerationbyfocused

excitationofinhomogeneouslydistributedscatters[J].Op-ticsCommunications,2001,196:325-330.

[6]Georgilou,TheodossiouT,HovhannisyanV,eta.lSecond

BiophysicalJournal,1999,77

7:

andthirdopticalharmonicgenerationintypeIcollagen,bynanosecondlaserirradiation,

overabroadspectralregion

[J].OpticsCommunications,2000,176:253-260.[7]GauderonR,LukinsPB,SheppardCJR.Optimizationof

second-harmonicgenerationmicroscopy[J].2001,32(7):691-700.

[8]ChuShi-wei,LiuTzu-ming,SunChi-kuang,

GHzrepetitionrateTi:sapphirelaser[J].press,2003,11(8):933-938.

[9]VolodymyrNikolenko,BoazNemet,RafaelYuste.Atwo-photonandsecond-harmonicmicroscope[J].Methods,2003,30(1):3-15.

[10]FreundI,DeutschM,SprecherA.Connectivetissuepo-larity.Opticalsecond-harmonicmicroscopy,summation,

crossed-beam

andsmall-anglescatteringinrat-tailtendon

eta.lReal-OpticsEx-timesecond-harmonic-generationmicroscopybasedona2

Micron,

[J].BiophysicalJournal,1986,50(4):693-712.

第1期屈军乐,等:二次谐波成像及其在生物医学中的应用

eta.lSec-Optics,2005,10(2):024013.

　9

[11]MengHan,LeanderZickler,GuenterGiese,

ondlaserablation[J].2004,9(4):760-766.

ond-harmonicimagingofcorneaafterintrastromalfemtosec-JournalofBiomedicalOptics,

[22]YiciGuo,HowardESavage,FengLiu,eta.lSubsurface

tumorprogressioninvestigatedbynoninvasiveopticalsec-ondharmonictomography[J].PNAS,1999,96(19):10854-10856.

[23]AlvinTYeh,BunshoKao,WoongGyuJung,

eta.lIma-gingwoundhealingusingopticalcoherencetomographyandmultiphotonmicroscopyinaninvitroskin-equivalenttissuemodel[J].JournalofBiomedicalOptics,2004,9(2):248-253.

[24]WarrenRZipfel,RebeccaMWilliams,RichardChristie,

eta.lLivetissueintrinsicemissionmicroscopyusingmul-tiphoton-excitednativefluorescenceandsecondharmonicgeneration[J].PNAS,2003,100(12):7075-7080.[25]AikaterineZoumi,XiaoL,GhassanSKassab,eta.lIma-gingcoronaryarterymicrostructureusingsecond-harmonicandtwo-photonfluorescencemicroscopy[J].BiophysicalJournal,2004,87(4):2778-2786.

[26]PatrickStoller,Beop-MinKim,AlexanderMRrubenchik,

eta.lPolarization-dependentopticalsecond-harmonicima-gingofarat-tailtendon[J].tics,2002,7(2):205-214.

[27]PaulJCampagnola,LeslieMLoew.Second-harmonicima-gingmicroscopyforvisualizingbiomoleculararraysincells,tissuesandorganisms[J].NatureBiotechnology,2003,21(11):1356-1360.

[28]LaboratoryforScientificInstrumentationandEngineering.

[EB/OL].[2005-07-10].http:∥lasie.ap.eng.osakau.ac.jp/res_shg.html,Multifocussecond-harmonicgenera-tionmicroscopyforlivecell/tissueobservation

[29]AndrewCMillard,MarkTerasaki,LeslieMLoew.Second

harmonicimagingofexocytosisatfertilisation[J].Bio-physicalJournal,2005,88:L46-L48.

[30]ThierryBoulesteix,EmmanuelBeaurepaire,Martin-Pierre

Sauviat,eta.lSecond-harmonicmicroscopyofunstainedlivingcardiacmyocytes:measurementsofsarcomerelengthwith20nmaccuracy[J].OpticsLetters,2004,29(17):2031-2033.

【中文责编:英　子;英文责编:雨　辰】

JournalofBiomedicalOp-

[12]YiJ,IvanVTomov,YiminW,eta.lHigh-resolutionsec-ond-harmonicopticalcoherencetomographyofcollageninrat-tailtendon[J].AppliedPhysicsLetters,2005,86:133901-133903.

[13]TakeshiYasui,YoshiyukiTohno,TsutomuArak.iCharac-terizationofcollagenorientationinhumandermisbytwo-di-mensionalsecond-harmonic-generationpolarimetry[J].JournalofBiomedicalOptics,2004,9(2):259-264.[14]LINXing-sun,PANLin,HUJin-yun,eta.lBackward

second-harmonicimagingoflivingbiologicaltissues[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics,2004,31(1):83-88(inChinese).

[15]GuyCox,EleanorKable,AllanJones,eta.l3-Dimension-alimagingofcollagenusingsecondharmonicgeneration[J].JournalofStructuralBiology,2003,141(1):53-62.[16]PaulJCampagnola,AndrewCMillard,MarkTerasaki,et

a.l

Three-dimensionalhigh-resolutionsecond-harmonicgenerationimagingofendogenousstructuralproteinsinbio-logicaltissues[J].BiophysicalJournal,2001,81(1):493-508.

[17]BouevitchO,LewisA,PinevskyI,eta.lProbingmem-branepotentialwithnonlinearoptics[J].Journal,1993,65(2):672-679.

[18]AndrewCMillard,LeiJ,AaronLewis,eta.lDirectmeas-urementofthevoltagesensitivityofsecond-harmonicgener-ationfromamembranedyeinpatch-clampedcells[J].OpticsLetters,2003,28(14):1221-1223.

[19]DanielADombeck,MireilleBlanchard-desce,WattW

Webb.Opticalrecordingofactionpotentialswithsecond-harmonicgenerationmicroscopy[J].TheJournalofNeu-roscience,2004,24(4):999-1003.

[20]AndrewCMillard,LeiJIN,Mei-deWei,eta.lSensitivity

ofsecond-harmonicgenerationfromstyryldyestotrans-membranepotential[J].BiophysicalJournal,2004,86(2):1169-1176.

[21]GuyCox,NunoMoreno,JoséFeij .Second-harmonicima-gingofplantpolysaccharides[J].

JournalofBiomedical

Biophysical