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首都师范大学 生命科学学院 生物化学及分子生物学系 2004 年 8 月

目 录

实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一

蛋白质的性质实验 蛋白质含量的测定 氨基酸的薄层层析 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 酵母 RNA 的水解及其组成成分的鉴定 细菌总 DNA 的提取和鉴定 底物浓度对酶促反应速度的影响 pH 对酶促反应速度的影响 维生素 C 含量的测定 葡萄糖氧化酶法测定血糖含量 血清谷丙转氨酶(SGPT)的测定

3 8 10 13 18 20 23 25 26 30 31

2

实验一

蛋白质的性质实验

【目的和要求】

1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。 3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的 原理及其相互关系。

【实验原理】

（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应

蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。

1. 双缩脲反应

尿素被加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲 在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。

所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双 缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

2. 茚三酮反应

蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈 黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。 除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺 化合物都有此反应。该反应灵敏度达 1：1500 000（pH5-7） 。现已广泛地用于氨基酸定 量测定。

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3. 黄色反应

凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。 芳香族氨基酸及含有酪 氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色 反应。

(二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定

蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋 白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既 不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶 液的pH值低于蛋白质等电点时，即在 H+ 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳 离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为 阴离子。

本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时 蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。

(三) 蛋白质的沉淀反应

蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗 粒的稳定性是有条件的、 相对的。 在一定的物理化学因素影响下， 蛋白质颗粒失去电荷、 脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的 沉淀反应。该反应可分为以下两种类型:

1. 可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化， 基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉 淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白 质的短时间作用以及等电点沉淀等。 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。 蛋白质是亲水 胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带 的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天

4

然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。 沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓 度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐 析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。

2. 不可逆的沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白 质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中， 这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、 超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。 蛋白质在水溶液中是酸碱两性电 解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言） ，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 金属离子，如Zn 、Cu 、Hg 、Pb 、Fe 结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以 其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶 性的盐类而沉淀。 经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中， 说明它已发生了变性。 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液 中的蛋白质; 临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或 硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。 蛋白质在有机酸的作用下带正电荷， 与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而 沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此 得到广泛应用。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 卵清蛋白溶液：取 5ml 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 100ml，搅拌均匀后用 4—8 层 纱布过滤,新鲜配制。 2. 0.5% 酪蛋白(以 0.01N NaOH 作溶剂) 3. 酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白 0.25 克，加蒸馏水 20ml 及 1.00N NaOH 溶 液 5ml (必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加 1.00N 醋酸 5ml ((必须准确)，倒入 50ml 蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于 0.10N 醋酸钠溶液内，酪蛋 白的浓度为 0.5% 。 4. 蛋白质-NaCl 溶液: 取 20ml 蛋清,加蒸馏水 200ml 和饱和氯化钠溶液 100ml，充 分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白） 。 5. 0.5% 甘氨酸，0.3% 酪氨酸，0.5% 色氨酸

5

6. 尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇溶液，浓硝酸，10%NaOH 7. 0.01%溴甲酚绿指示剂， 0.02N HCl， 0.02N NaOH， 0.01N HAc， 0.10 N HAc， 1.00N HAc 8. 饱和硫酸铵溶液, 硫酸铵粉末, 2%硝酸银, 0.1%硫酸铜, 饱和硫酸铜, 10%三氯乙 酸,

（二）器材

试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。

【实验方法】

1. 双缩脲反应

取少量尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化 时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入 10 滴双缩脲试剂，混匀, 观察颜 色变化。 另取 1 支试管，加入卵清蛋白溶液 1ml 再加入 5 滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色 变化。

2. 茚三酮反应

取 2 支试管， 分别加入卵清蛋白溶液和 0.5%甘氨酸溶液 4 滴 ， 再加入 2 滴 0.1% 茚 三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热 1-2 分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨 基酸呈色深浅。

3. 黄色反应

按下表分别向 6 支试管中加入试剂，微火小心加热(不必沸腾)，观察颜色变化。再 滴加 10% NaOH 溶液使呈碱性，观察颜色变化。 管号 样品(滴) 4 浓硝酸 (滴) 2 4 2 4 2 4 2 少许 20 少许 20 1 卵清蛋白 2 3 0.3%酪氨酸 0.3%色氨酸 4 5%苯酚 5 指甲 6 头发

6

4. 蛋白质的两性反应

（1） 取 1 支试管，加入 1ml 0.5% 酪蛋白和 5-7 滴 0.01% 溴甲酚绿指示剂（变色范 围是 pH 3.8—5.4，在酸性溶液中为黄色，在碱性溶液中为蓝色） ，混匀，观察溶液的颜 色。 （2）用滴管缓慢加入 0.02N HCl 溶液，随加随摇，直到有大量沉淀产生。说明原因， 并观察溶液颜色的变化。 （3）继续滴入 0.02N HCl 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，说明原因。 （4）再缓慢滴入 0.02N NaOH 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化过程，说明原因。

5. 酪蛋白等电点的测定

取 9 试管编号后按下表顺序准确加入试剂。加入每种试剂后应混匀。 （单位：ml） 1 管号 试剂 蒸馏水 1.00N HAc 0.10N HAc 0.01N HAc 酪蛋白-NaAc 溶液的最终 pH 沉淀出现的情况 2 3 4 5 6 7 8 9

2.4 1.6 — — 1.0 3.5

3.2 0.8 — — 1.0 3.8

— — 4.0 — 1.0 4.1

2.0 — 2.0 — 1.0 4.4

3.0 — 1.0 — 1.0 4.7

3.5 — 0.5 — 1.0 5.0

1.5 — — 2.5 1.0 5.3

2.75 — — 1.25 1.0 5.6

3.38 — — 0.62 1.0 5.9

静置约 20 分钟,观察每支试管内的混浊度,以-,+,++,+++,++++符号表示沉淀的多少。 根据观察结果，指出哪个 pH 是酪蛋白的 pI。

6. 蛋白质的盐析作用 (选做)

取 1 支试管，加入 3ml 蛋白质- NaCl 溶液和 3ml 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置 10 分钟，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌， 至粉末不再溶解，析出的沉淀为清蛋白。静置，弃上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀 释，观察它是否溶解。

7. 重金属沉淀蛋白质 (选做)

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取 2 支试管， 各加入约 1ml 卵清蛋白质液， 分别加入 2% 硝酸银溶液及 0. 1% 硫 酸铜溶液 1 滴，观察沉淀的生成。 对第 2 支试管再加入过量的饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。

8. 有机酸沉淀蛋白质 (选做)

取 1 支试管，加入卵清蛋白质液约 0.5ml，然后滴加 10% 三氯乙酸溶液数滴，观 察沉淀的生成。

【思考题】

1. 如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此作何结论? 2. 茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调? 若不是，为什么? 3. 在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低? 4. 蛋白质分子中的哪些基团可以与 (1)重金属离子作用而使蛋白质沉淀? (2)有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀?

实验二

蛋白质含量的测定

【目的和要求】

1. 了解 Folin 酚法（Lowry 法）和考马斯亮蓝 G250 法的基本原理。 2. 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的基本操作。 3. 学会使用 722 型分光光度计的使用方法。

【实验原理】

Folin酚法：Folin酚法所用的试剂由两部分组成。试剂甲由Na2CO3、NaOH、CuSO4 及酒石酸钾钠组成。 蛋白质中的肽键可与酒石酸钾钠铜盐溶液反应， 生成紫红色络合物。 试剂乙由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴组成。此试剂在碱性条件下易被蛋白质中酪氨酸的

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酚基还原生成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的浓度成正比，测定范围 约在 25-250μg / ml蛋白质。 考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝 G250 在酸性溶液中呈茶棕色，最大吸收峰在 465nm。 考马斯亮蓝可与蛋白质以范德华力结合。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转 至 595nm，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，测定范围 1-100μg / ml 蛋白质。 以上两种方法是常用的测定蛋白质含量的方法，但各有优缺点。Folin-酚反应的干 扰物质较多，如蔗糖、硫酸铵、巯基化物、柠檬酸、酚类物质等。因此，可根据实际情 况选择使用或结合使用以上两种方法。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 标准蛋白溶液: (1) Lowry 法：配置成 250μg / ml 的蛋白溶液。 （2）考马斯亮蓝 法：配置成 100μg / ml 的蛋白溶液。以上蛋白溶液均可用生理盐水配制。 2．Folin酚甲试剂：将 1gNa2CO3溶于 50ml 0.1mol/L的NaOH中，再把 0.5gCuSO4溶 于 100ml 1% 酒石酸钾钠溶液，然后将前者 50ml与后者 1ml混合。混合后一日内使用有 效。 3．Folin 酚乙试剂：在 1.5L 容积的磨口回流瓶中加入 100g 钨酸钠、25g 钼酸钠、 700ml 蒸馏水、50ml85%磷酸及 100ml 浓盐酸，充分混匀后回流 10 小时。完后，再加 150g 硫酸锂、50ml 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴， 冷却后定容到 1000ml，过滤即成 Folin 酚乙贮存液。此液如显绿色，可加溴水数滴至溶 液呈黄色，置于棕色瓶中，可在暗处长期保存。使用前用标准 NaOH（1mol /L）溶液滴 定，酚酞为指示剂，当溶液颜色变为紫红、紫灰，再突然转变成墨绿时即为终点。该试 剂的酸度一般为 2mol /L 左右。使用时稀释约 1 倍，最终酸度为 1mol /L。 4. 考马斯亮蓝 G250 试剂 称 100mg 考马斯亮蓝 G250， 溶于 95%乙醇后， 加蒸馏水约 800ml， 85%磷酸 100ml， 加 最后补足水到 1000ml，混匀过滤，保存在棕色瓶中，可使用数周，但使用前需重新过 滤。

（二）器材

试管及试管架， 0.1、0.5 、1 及 5ml 吸量管，恒温水浴，722 型分光光度计。

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【实验方法】

（一）样品的制备

用台秤称取小白菜或其他植物 10g， 用剪刀剪碎后， 在研钵里碾成匀浆， 加水 30ml， 继续碾 10 分钟， 到入离心管中， 另加 5 ml 水将剩余物洗进离心管中， 平衡后于 1000r/ min 离心 15 分钟，取上清 10ml 定容到 100ml, 待测。

（二）标准曲线的制作与样品测定

按下表操作。A: Folin 酚法（Lowry 法）B: 考马斯亮蓝 G250 法

标准曲线 小白菜 纯的蛋白质溶液 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.4 0.4 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.6 0.6 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，室温下放置 10 分钟 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，30℃15~30 分钟，650nm 读光密度值 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 0.1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1.0 1.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，室温下放置 5~30 分钟，595nm 读光密度值

A

管号 样品 水 F甲 F乙 管号 样品 水 G250

B

【注意事项】

1. 蛋白质样品和显色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去。 2. 染料与蛋白质形成的蓝色化合物易轻度沾附试管壁或比色皿，使用完应立即冲洗干 净。 3. 待测样品的浓度超出测定范围时，应对样品做适当处理，使其浓度在标准曲线测试 范围内。

【思考题】

1. 分别计算出两种方法测得的小白菜中蛋白质的含量，比较二者的结果，说明有 什么不同？ 2. 测定植物材料中蛋白质含量时，上述两种方法你会选择哪一种？

10

实验三 氨基酸的薄层层析

【目的和要求】

1. 了解聚酰胺薄膜层析的基本原理。

2. 掌握聚酰胺薄膜层析的操作技术。

【实验原理】

聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸

及其衍生物的分析。具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。 聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。由乙二酸和乙二胺聚合而成的，

称锦纶66。

nHOOC(CH2) 4COOH + nH2N(CH2) 6NH 2

↓

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一

层锦纶制成的。聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和-NH- 能与被分离物质的一定基团形成H 键。如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H 键。在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H 键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中

各成分分离。 物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf 来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf 值，因此，用Rf 可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。氨基酸层析图谱常用

茚三酮作显色剂。本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】

(一) 试剂

1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）

3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）

4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材

聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器， 塑料手套等。

【实验方法】

(一) 薄膜的剪裁

取薄膜（7cm ×10cm ）一张，在纸的一端距边缘2cm 处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2cm ）。

(二) 点样

氨基酸的点样量以5ul 为宜。点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm 。点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。为加快样品干燥，可用吹风机吹干，注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸。

(三) 展层

在层析缸中放一个小培养皿，培养皿中倒入适量展层剂，将点好样品的薄膜斜立于培养皿中（注意点样的一端在下），展层剂的液面需低于点样线１厘米。当溶剂前沿距上边缘１厘米处时，取出膜片，立即用笔标出溶剂前沿的位置，自然干燥或用吹风机吹干。

（四）定性鉴定

用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均匀喷雾。晾干后，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf 值。

在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf 值），确定氨基酸混合样中氨基酸的种

类及位置。

【注意事项】

1. 选用合适、洁净的薄膜。勿用手直接接触薄膜。

2. 点样斑点不能太大（其直径应小于2mm ）。吹风机温度不宜过高，否则斑点变黄。

3. 根据一定目的、要求，选择合适的溶剂系统。

【思考题】

1. 做好本实验的关键是什么?

2. 实验操作过程中，为什么不能用手直接接触薄膜?

实验四 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳

【目的和要求】

1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理

2. 掌握垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶的配制方法。

3. 学会利用相对迁移率分析蛋白质种类。

【实验原理】

带电颗粒在电场的作用下，向着与其相反的电极移动，称为电泳。

电泳做为一种物质分离及鉴定技术，其原理在于任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。蛋白质是两性电解质，在一定的pH 条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质和溶液的pH 值和离子强度。处于pI 的蛋白质分子所带的电荷为零，在电场中不移动。若pH ＜pI ，蛋白质分子带正电荷，在电场中向负极移动，pH ＞pI 的情况正好相反。

目前所采用的电泳方法大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛，区带电泳按其支持物的物理性状，可以分为四大类：（1）滤纸电泳及薄膜电泳（如醋酸纤维素薄膜电泳）；（2）粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳等；

（3）细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳；（4）凝胶电泳：如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr ）和少量的交联剂N ，N ˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis ）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N ， N ，N ˊN ˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE 应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。

PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH 及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、pH 、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。

（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）

电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。

（2）不连续系统对样品的浓缩效应

凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

缓冲液离子成分和pH 的不连续性：在两层凝胶中均有Tris 和HCl 。Tris 的作用是维持溶液的电中性及pH 。HCl 在一定pH 条件下易解离出Cl -，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很

小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI 在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。

此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。

（3）电荷效应

在分离胶中，各种血清蛋白所带静电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快，反之则慢。

因此各种蛋白质按照电荷多少、分子量大小及分子形状以一定顺序排成一个个区带。不连续PAGE 所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了它的分辨率。

电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法，其比氨基黑染色法灵敏度高，可以进行定量扫描，比银染法简便。

本次实验是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法来分离各种血清蛋白。血清中含有前清蛋白、清蛋白、α-球蛋白、β- 球蛋白、γ- 球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于分子量、等电点及形状不同，在电场中的泳动速度不同。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 制备分离胶、浓缩胶有关试剂

（1）凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g ，加重蒸水溶解后，定容到100ml 。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

（2）pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml ， 4℃保存。

（3）pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml ， 4℃保存。

（4） TEMED（四乙基乙二胺）原液

（5）10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

2. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液

称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g ，加蒸馏水约900ml ，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml 。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

3. 50% (v/v)甘油

4. 1% (w/v) 溴酚蓝：称取100mg 溴酚蓝，加蒸馏水10ml ，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

5. 5× 样品缓冲液（loading buffer）：10ml

3.1ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.7) 312.5mmol/L

5ml 50% (v/v)甘油 25%

0.5ml 1% (w/v) 溴酚蓝 0.05%

1.4ml 蒸馏水

4. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg 考马斯亮蓝G250，溶于200ml 蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml ，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

6. 1%琼脂

7. 鸡血清

（二）器材

电泳仪、垂直板电泳槽，微量加样器、长针头注射器、烧杯、试管、滴管、平皿等。

【实验方法】

（一）电泳装置的安装

夹心式垂直平板电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽之间夹有一个凝胶模。该模有一个U 形硅胶框，长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上）、下贮槽（白金电极在下）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠螺丝固定。各部件依下列次序组装：

1. 上贮槽上装上螺钉，仰放在桌上。

2. 将长、短玻璃板分别插到U 形硅胶框的凹形槽中。玻璃板应干净、干燥，注意勿用手接触灌胶的一面。

3. 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

4. 将下贮槽的销孔对准已装好螺钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝。

5. 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界处的缝隙内用滴管假如已熔化的1%琼脂。目的是封住空隙，凝固后琼脂中应避免有气泡。

(二) 制胶

1. 在小烧杯里按下表配好分离胶（充分混匀，但不能带入太多的空气）

总体积 凝胶贮液 pH8.9分离胶缓冲液dH 2O TEMED

12.5ml 10%过硫酸铵 20ml 5.0ml 2.5ml 0.01ml 0.15ml

将配好的分离胶沿着高玻璃一边缓缓地倒入玻璃板之间，约10cm 高，倒好后，电泳槽垂直放好，用长针头注射器吸取1~2ml dH2O ，针头平口一边贴着玻璃慢慢地在胶面上封上一层水，这时胶与水交界面处能看到一条清晰的界面，后逐渐消失。置30~40分钟后，又出现清晰的界面，用长针头注射器小心吸出水，用滤纸吸干剩余的水分。

2. 在小烧杯里按下表配好浓缩胶（充分混匀）

总体积 凝胶贮液 PH6.7分离胶缓冲液dH 2O TEMED

7.65ml 0.005ml 10%过硫酸铵 0.1ml 10ml 1.0ml 1.25ml

将小烧杯中的浓缩胶沿着高玻璃一边缓缓地倒入玻璃板中已凝聚好的分离胶上，直到离玻璃板顶端5~10mm时，插入梳子，约15~20分钟，待胶凝固后，小心地取出梳子，即可见多个样品槽。

（三）点样

1. 用大烧杯取适量电极缓冲液加到电泳槽中，电极缓冲液应盖住矮玻璃。接上电源，电压调到50V ，用加样枪取10~30μl 样品加到样品槽中。

2. 将电压调到100V ，等到溴酚蓝走过浓缩胶后，将电压调到150V ，待溴酚蓝离底部0.5cm 时（约3小时），切断电源。

（四）剥胶、染色、脱色

松开四个螺丝，取出夹胶的玻璃板并置水中，轻轻地将玻璃板与胶分离。用刀切下浓缩胶，分离胶放入盛有染色液的大平皿中，1小时后，将染色液倒入回收瓶中，将胶用水洗几次，加入脱色液，放到脱色摇床上进行脱色，一段时间后看结果。

（五）结果判断

脱色后的凝胶上一般可清楚呈现若干区带，分别为前清蛋白、清蛋白、球蛋白（多条），可将它们各自的位置判断出来。

（六）制备凝胶干板

常用凝胶真空器制备干板。若无此仪器，可将脱色后的胶板浸泡在保存液中3~4小时。然后，在大培养皿内平放一块干净玻璃板（13x13cm ），倒少许保存液，在玻璃板上均匀涂开，取一张预先在蒸馏水中浸透的玻璃纸，平铺在玻璃板上，赶走气泡，小心

取出凝胶平铺在玻璃纸上，赶走气泡。再取一张浸泡过的玻璃纸覆盖在凝胶上，赶走气泡，将四边多余的玻璃纸紧紧贴于玻璃板的背面。平放于桌上自然干燥1-2天，即可得到平整、透明的干胶板，可长期保存不褪色，便于定向扫描。

【注意事项】

1. 制备凝胶应选用高纯度试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。

2. 若硅橡胶条、玻璃板不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂。为防止此现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条、梳子可用“洗涤灵”清洗。玻璃板需用重铬酸钾洗液浸泡3-4小时，或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20分钟以上，用清水冲洗，再用“洗涤灵”刷洗，最后用蒸馏水冲洗，用乙醇冲洗后阴干。

3. 电泳装置安装时，各部件位置要适当，旋紧螺丝时应均匀用力，以免缓冲液渗漏。

4. 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流通过。

5. 凝胶完全聚合后，必须放置30~60分钟，使其充分“老化”后，才能轻轻取出梳子，切勿破坏加样槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。

【思考题】

1. PAGE 方法中如何调节凝胶的孔径？

2. 电极缓冲液用过后是否还能利用？为什么？

3. 做好PAGE 的关键步骤有哪些？为什么？

实验五 酵母RNA 的水解及其组成成分的鉴定

【目的和要求】

1. 了解从酵母中提取 RNA 的原理和方法。

2. 了解定性鉴定核酸的原理和方法。

【实验原理】

酵母含RNA 达2.67—10.0%，DNA 则少于0.03—0.516％。为此，提取RNA 多以酵母为原料。 稀碱法使用稀碱（本实验用0.2% NaOH溶液）使酵母裂解，然后用酸中和, 除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。由此得到的 RNA为变性的RNA ，可用作制备核苷酸的原料。

用硫酸水解 RNA 后, 可生成磷酸、戊糖和碱基, 各成分用以下反应加以鉴定：

（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵 [(NH)3PO 4·12MoO 3]沉淀。

（2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。

（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

酵母粉，0.2％氢氧化钠，乙酸，95％乙醇，无水乙醚，10%硫酸，浓硝酸，0.1N 硝酸银，1N 氨水。

酸化乙醇：100ml 95%乙醇，加1ml 浓盐酸，pH

钼酸铵试剂：将2g 钼酸铵溶解在100ml 10% 硫酸中。

地衣酚试剂：100ml 浓盐酸加入100mg 三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入476 mg地衣酚。

二苯胺试剂：将4g 二苯胺溶于400ml 冰醋酸中，再加入11ml 浓硫酸（比重1.84）。若冰醋酸不纯，试剂呈兰色或绿色，则不能使用。

（二）器材

试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，锥形瓶，表面皿，漏斗，量筒，三用水箱, 离心机，抽滤装置。

【实验方法】

（一）酵母 RNA 提取

称取4克干酵母粉，放入100毫升烧杯中，加入40毫升0.2％氢氧化钠。在沸水浴中加热30分钟，常搅拌。冷却后，3800rpm 离心15分钟。取上清液，加30ml 酸化乙醇，搅拌，静置5分钟。然后3000转离心15分钟。弃上清，保留沉淀，沉淀即为粗RNA 。

（二）RNA 的水解

向 50ml 锥形瓶中加入 0.1-0.2 克粗酵母 RNA 和 10% H 2SO 4 15ml 。沸水浴 20 分钟后，3800rpm 离心5分钟，取上清液进行下列实验。

（三）组分鉴定

1. 磷酸的检验

取 2ml 上清液放入 1 支试管中加入 5 滴浓 HNO3和 1ml 钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

2. 戊糖的检验

取 2 支试管, 各加入 1ml 滤液, 分别加入等体积的地衣酚试剂和二苯胺试剂, 在沸水浴中加热10-15 分钟。比较两支试管的颜色, 并解释。

3. 嘌呤碱基的检验

取 1 支试管, 加入 1ml 0.1N AgNO 3溶液, 再逐滴加入 1N 氨水至沉淀消失。然后加入 1ml 滤液, 放置片刻，观察有无白色嘌呤银化物沉淀产生（见光变为红棕色）。

【注意事项】

1. 用乙醇、乙醚清洗RNA 时应用玻棒小心搅动沉淀，抽干，可得白色RNA 粉末。

2. 水解组分鉴定时，应将试管清洗干净，否则会影响现象的观察。

【思考题】

现有三瓶未知溶液，分别为蛋白质、糖、RNA ，请设计实验将它们区别开来。

实验六 细菌总DNA 的提取和鉴定

【目的和要求】

1. 学会CTAB 法提取细菌总DNA 。

2. 掌握DNA 的琼脂糖凝胶电泳法。

【实验原理】

DNA 在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB （溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB 与核

酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA 的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA 分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA 分子或DNA 片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。

【实验试剂和器材】

（一）试剂：

菌株（E.coli ）；蛋白酶K （20mg/ml）；；琼脂糖；标准DNA 水解液

1. 10%SDS

2．酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）

3. 异丙醇；70%乙醇

4．LB 培养基：蛋白胨10g, 酵母粉5g, NaCl 10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。

5．TE 缓冲液：10mM Tris• HCl, 0.1mM EDTA (pH8.0)。

6． CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65℃使之溶解，然后室温保存。

7．TAE 缓冲液（50×） (pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris, 57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA 。电泳时稀释成1× 浓度使用。

8．溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

9．0.5ug/ml 溴乙啶染液：称取5mg 溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml, 取1ml 此溶液用1xTAE 缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5ug/ml。

（二）器材：

锥形瓶（250ml ），1.5ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪

【实验方法】

（一）细菌总DNA 的提取

1. 将菌株接种于液体LB 培养基，37℃震荡培养过夜。

2. 取1.5ml 培养物12000rpm 离心2min 。

3. 沉淀物加入567 ul的TE 缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul 的蛋白酶K ，混匀，于37℃温育1h.

4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min 。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA 沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6. 沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20ul TE缓冲液(含RNaseA ﹤25ng/ml)中，准备电泳检测。

（二）琼脂糖凝胶电泳

1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE 缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5-1h ，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

2. 加样：取0.5-1 ug 左右的样品，体积为10-20ul ，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA 水解液，在同一凝胶板上进行电泳。

3. 电泳：维持恒压100V ，电泳0.5-1h ，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

4. 染色：

将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h 。染液可反复多次使用。

5. 观察：

将凝胶板置于254nm 波长紫外灯下进行观察。DNA 存在的位置呈现橙黄色荧光。

【注意事项】

1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

2. 倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。

【思考题】

1. 分子量大小不同的DNA 样品电泳分离后在凝胶上的排列顺序应是怎样的？为什么？

2. 溴乙啶有毒，它的作用机理是什么？

实验七 底物浓度对酶促反应速度的影响

【目的和要求】

1. 学会测定酶反应速度的基本方法。

2. 掌握测定米氏常数Km 值的原理和方法。

【实验原理】

酶反应的速度可以用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。所以反应速度的单位是浓度/单位时间。

酶的底物浓度与反应速度的关系一般符合米氏（Michaelis-Menten ）理论。 米氏公式：

v =V max ⋅[S]

K m +[S] 本实验以乳酸脱氢酶（LDH ）为例，利用双倒数作图法，测定Km 值。 LDH 催化的反应为：

Pyruvate + NADH + H+ L-lactate + NAD+

反应速度可以用单位时间内NADH 的减少量来表示。根据公式∆ A = ε×∆ C ×d 求出NADH 的浓度变化，即可测出反应速度。（340 nm, εNADH = 6.2x106 cm2/mol）

【实验试剂和器材】

（一）试剂：0.1M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）；0.01M NADH; 10M 丙酮酸钠；LDH

（二）器材：紫外分光光度计，移液枪，吸头，1.5ml 小离心管，离心管架

【实验方法】

（一）酶活性的测定：

在1.5 ml小离心管中分别加入：

0.1M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）

0.01M NADH

0.02ml 0.1M 丙酮酸钠

0.94 ml 0.02ml 0.02ml

混匀以上试剂，然后倒入比色皿中。将比色皿放入分光光度计后，分别加入不同稀释浓度0.02ml LDH酶液，测定在340nm 处，OD 值随时间变化的曲线，由此来确定LDH 的使用浓度。

（二）米式常数的测定：

1. 分别配制下列浓度的丙酮酸钠溶液：

0.05、0.15、0.25、0.40、0.75、1.25和2.5M 。

2. 在1.5 ml小离心管中分别加入：(总体积为1ml 反应液)

0.1M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）

0.01M NADH

0.02ml 不同浓度的丙酮酸钠 0.94 ml 0.02ml 0.02ml

3. 混匀以上试剂，倒入比色皿中，然后将比色皿放入分光光度计后读取340nm 处OD 值，加入0.02ml LDH使用液，迅速搅匀，使反应开始，1分钟后再读取OD 值。

4. 计算反应液中底物的初始浓度，并根据测得的OD 值的变化，利用比尔-朗伯公式计算出反应初速度，填入下表： V (mM/min) 丙酮酸钠浓度S （mM ） ΔA

5. 利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/V，分别求出V max 和K m 。

【注意事项】

1. 不同浓度的底物浓度可以用0.1M 的丙酮酸钠稀释而成，这样可以减少操作中的误差。

2． 应尽量保持恒温。

【思考题】

1. Km 值的物理意义是什么？为什么要用酶反应初速度计算Km 值？

2. 除了双倒数作图法，还有什么方法可以求出km 值？

实验八 pH 对酶促反应速度的影响

【目的和要求】

1. 了解pH 对酶促反应速度的影响。

2. 学习测定酶的最适pH 的方法。

【实验原理】

酶促反应受环境pH 的影响极为显著。 通常各种酶只有在一定的pH 范围内才表现它的活力，一种酶表现其活性最高时的pH 值，称为该酶的最适pH 。低于或高于酶的最适pH 时，酶的活性逐渐降低。不同酶的最适pH 值不同。本实验仍以乳酸脱氢酶催化的反应为例，学习测定酶的最适pH 的方法。

【实验试剂和器材】

（一）试剂：

1. 不同pH 值的缓冲液:

100ml 0.33M柠檬酸，100ml 0.33M磷酸，3.54g 硼酸，343ml 1M NaOH, 加水直到1升。用HCl 滴定成pH 值3.0、3.5、4.0、4.5直到12的不同pH 值缓冲液。

2. 0.01M NADH

3. 0.1M 丙酮酸钠

4. LDH

（二）器材：同实验7。

【实验方法】

（一）酶活性的测定：方法同实验7中的步骤1。

（二）pH 对酶促反应速度的影响：

1. 在1.5 ml小离心管中分别加入：(总体积为1ml 反应液)

不同pH 值的缓冲液

0.01M NADH

0.02ml 0.1M 丙酮酸钠

0.94 ml 0.02ml 0.02ml

2. 混匀以上试剂，倒入比色皿中，然后将比色皿放入分光光度计后读取340nm 处OD 值，加入0.02ml LDH使用液，迅速搅匀，使反应开始，测定反应1分钟OD 值的变化。

3. 根据所测得的OD 值的变化，计算出反应初速度，填入下表： V (mM/min) 缓冲液pH 值 ΔA

3. 以pH 为横坐标，反应速度为纵坐标做出v – pH曲线图，求出LDH 的最适pH 值。

【思考题】

1. 酶反应的pH 是否是一个常数？它与哪些因素有关？

2. pH 对酶活性有何影响？

实验九 维生素C 含量的测定

【目的和要求】

1. 学习定量测定维生素C 的原理和方法。

2. 进一步掌握滴定法的基本操作技术。

3. 了解松针、水果及蔬菜中维生素C 的含量情况。

【实验原理】

维生素C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称抗坏血酸。它对物质代谢的调节具有重要的作用。

维生素C 是具有L 系糖构型的不饱和多羟化合物，属于水溶性维生素。她分布很广，植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、

西红柿等）中的含量更为丰富。

维生素C 具有很强的还原性。它可分为还原型和脱氢型（氧化型）。根据它具有的还原性质可测定其含量。

还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚(Dichlorophenolindo phenol，简写 DCPIP) ，本身则氧化成脱氢型。在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。

因此，当用2，6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未被全部氧化前，则滴下的染料立即被还原成为无色。一旦溶液中的抗坏血酸已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时即表示溶液中的抗坏血酸刚刚被全部氧化，此时即为滴定终点。从滴定时2，6-二氯酚靛酚标准溶液的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。

该法简便易行，但有下列缺点:1。在生物组织内和组织提取液中，抗坏血酸能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在。它们同样具有维生素的生理功能，但不能将2，6-二氯酚靛酚还原脱色。（总抗坏血酸的量常用2，4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定）2. 生物组织提取物和生物体液中常含有其它还原性物质，其中有些在同样的条件下也可使2，6-二氯酚靛酚还原脱色。3. 在生物组织中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 标准抗坏血酸溶液

准确称取10mg 纯抗坏血酸（应为洁白色，发黄则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml ，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。

2. 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液

准确称取250mg2,6-二氯酚靛酚溶于150ml 含有52mg NaHCO3 的热水中，冷却后加水稀释至250ml ，滤去不溶物, 贮于棕色瓶中冷藏(4℃) 约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸标定。

2%草酸溶液，1%草酸溶液。

（二）器材

架盘天平， 锥形瓶（100ml ），容量瓶，移液管，漏斗，微量滴定管（5ml ）等。

【实验方法】

（一）提取

水洗干净松针或整株新鲜蔬菜（或整个新鲜水果），用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后用天平准确称取松针（或蔬菜水果）约0.5克，放在研钵中，加2% 盐酸5-10毫升，研磨成浆状。滤纸过滤，将滤液滤入50毫升容量瓶中。滤饼可用少量2% 盐酸洗2-3次。最后用2%盐酸溶液稀释到刻度并混匀。

（二）标准液的滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml （含0.1mg 抗坏血酸）置100ml 锥形瓶中，加 9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至淡红色，并保持15秒不褪色, 即达终点。由所用染料的体积计算出1ml 染料相当于多少毫克抗坏血酸(取10ml 1%草酸作空白对照, 按以上方法滴定) 。

（三）样品的滴定

准确吸取滤液两份，每份10毫升分别放入两个锥形瓶（100ml ）内，滴定方法同前。另取两份10ml 1%草酸作空白对照滴定。

（四）计算

式中:VA :滴定样品提取液所用染料的平均毫升数

V B :滴定空白对照所用染料的平均毫升数

C:样品提取液总的毫升数

D:滴定时所取样品提取液的毫升数

W:待测样品的重量（g ）

T:为1ml 染料能氧化抗坏血酸的毫克数

【注意事项】

1. 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。

2. 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2分钟。因为在本滴定条件下，一些非维生素C 的还原性物质也可与2，6-二氯酚靛酚发生反应，影响结果。

3. 滴定所用2，6-二氯酚靛酚的量应在1-4毫升之间，超出或低于此范围，应增减样品液用量或改变提取液稀释度。

4. 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。

【思考题】

1. 为了测得准确的维生素C 含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？

2. 试简述维生素C 的生理意义

实验十 葡萄糖氧化酶法测定血糖含量

【目的和要求】

学习和掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的方法。

【实验原理】

方法参阅Trinder. P. Ann. Clin. Biochem.，1969, 6:24-27。

GOD

葡萄糖 + O 2 葡萄糖酸 + H 2O 2

POD

H 2O 2 + 4-氨基安替吡啉 + 酚醌亚胺 + H 2O

醌亚胺在480-550nm 范围内有最大光吸收峰，且醌亚胺的量与葡萄糖的量成正比，利用比色法测定醌亚胺的量，即可计算出血糖的含量。

【实验试剂和器材】

（一）试剂 试剂

R 1

R 2成分 葡萄糖氧化酶（GOD ） 过氧化物酶（POD ） 实验浓度 ≥13000U/L ≥900U/L 100mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 11mmol/L 酚 0.77mmol/L 4-氨基安替吡啉

葡萄糖标准液（100mg/dl）

试剂稳定性：原装试剂在2~8℃避光保存，有效期15个月。混合后2~8℃可稳定1个月，室温可稳定3天。

实验样品：新鲜无溶血血清。

（二）器材：

试管及试管架，吸量管，移液枪，恒温水浴，722型分光光度计。

【实验方法】

波长：505nm （480~550nm）温度：37℃；比色杯光径：1cm

1．将10mlR 1与90mlR 2混合均匀，既为工作液。桉下表操作： 工作液

重蒸水

标准

样品 空白管 标准管 样品管 0.01ml ─ ─ 0.01ml ─ ─ 0.01ml ─ ─ 2．分别混合均匀，37℃保温10~15分钟（避免太阳光直射），以空白管调零，分别读取A 标准及A 样品。

3．计算：

A 样品

葡萄糖浓度 ×标准浓度（mmol/L或mg/dl）

A 标准

参考值：4.22~6.11mmol/L（76~110mg/dl）

线形上限：葡萄糖浓度可达22.2mmol/L（400mg/dl）

【注意事项】

1．样品中的葡萄糖浓度超过22.2mmol/L（400mg/dl），可将样品量减半，改为5ul ，标准量不变，重测，结果乘以2。

2．试剂R 1为液体酶，注意防冻。

【思考题】

在比色法中，常用标准曲线法和标准管法，试比较这两种方法的优缺点。

实验十一 血清谷丙转氨酶(SGPT)的测定

【目的和要求】

1. 了解谷丙转氨酶活性测定的基本原理。

2. 掌握谷丙转氨酶活性测定的方法。

【实验原理】

血清谷丙转氨酶(SGPT)能催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸

性条件下与2，4－二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在520nm 处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。GPT 在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损， GPT 就释放到血液中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）

2. 丙酮酸标准液（2μMol/ml）

准确称取22mg 纯净丙酮酸钠，用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液定容至100ml 。

3. 谷丙转氨酶底物溶液

准确称取α－酮戊二酸29.2mg （2mM ）， DL－丙氨酸1.78g （200mM ），溶于50ml 0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液中，用20% NaOH调pH 为7.4，然后加以上磷酸盐缓冲液至100ml ，加几滴氯仿防腐，冰箱保存可放一周。

4. 2，4－二硝基苯肼溶液（1mM ）

称取2，4－二硝基苯肼20mg ，置于100ml 容量瓶中，先用10ml 浓盐酸溶解后，再加水稀释到刻度。

5. 0.4M氢氧化钠。

（二）器材

试管及试管架， 0.1、0.5 、1及5ml 吸量管，恒温水浴，722型分光光度计。

【实验方法】

（一）标准曲线绘制

取6支干燥洁净的试管，按下表操作：

各管摇匀，37℃水浴箱预热10分钟

2, 4－二硝基苯肼溶液

各管摇匀，37℃水浴箱预热20分钟 充分摇匀，在30分钟内，520nm 处比色

相当于丙酮酸（μMol ／ml ） 相当于酶活力（单位） A 520各测定管减空白管A 520值差

以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

（二）血清SGPT 活力测定

取4支干燥洁净试管，按下表操作：

【注意事项】

1. 在测定SGPT 时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。

2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U 时，需将样品稀释。

3. 转氨酶只能作用于α－L －氨基酸，对D －氨基酸无作用。实验室多用α－DL －氨基酸（较L －氨基酸价廉），若用L －氨基酸，则用量减半。

4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。

5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。

【思考题】

1. 什么叫转氨基作用？在蛋白质代谢中有何重要作用？

2. 为什么制作标准曲线时，需要加入一定量SGPT 底物溶液？

3. 为什么测定酶活力时需要有对照？