RNA的生物催化作用

RNA 生物催化作用的发现

20世纪70年代以前，人们一直认为生物体内的各种生化反应都是由蛋白质来催化完成的，而核酸则仅有存贮与传递信息的功能，与酶的催化反应无关。但70年代后期以来，Altman 及Cech 等发现RNaseP 的RNA 亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA 中的居间序列都具有酶的催化活性。经过10年来的研究已证明，RNA 是一种兼有遗传信息的存贮与传递及生物催化功能的生物大分子，这是科学家们对RNA 分子功能认识的一个重大突破。

(一)RNaseP 中的RNA 亚基的催化功能

1978年，Altman 在纯化RNaseP 时，发现一种377个核苷酸长的RNA 片段与一种蛋白质总是同时被纯化。另外，还发现RNaseA 及小球菌核酸酶都可使RNaseP 失活，RNaseP 的浮力密度显示RNA ——蛋白质复合物特性。在离体条件下，大肠杆菌RNaseP 的RNA 亚基与蛋白质亚基都不表现RNase 活性，但若把RNA 亚基与蛋白质亚基进行重组，则重组复合物具有RNA 酶活性。更进一步的研究发现，RNaseP 的RNA 亚基可在高Mg 2+浓度下，催化前体tRNA 的剪切，而蛋白质亚基则无此功能，从而说明RNaseP 的催化功能是由其RNA 亚基部分来承担的。

RNaseP 是一种核酸内切酶，在形成成熟的tRNA 时，用以切除tRNA 前体5’端附加顺序。大肠杆菌的RNaseP 可裂解60余种不同的前体tRNA ，并均作用于特定的磷酸二酯键上，而这些被切除部位的核苷酸顺序之间却是非同源的。现已在大肠杆菌、枯草杆菌等原核生物及某些真核生物细胞中发现RNaseP 的存在及其RNA 亚基在前体tRNA 剪接中的生物催化功能。

Altman 曾研究发现用RNaseP 的RNA 亚基裂解前体tRNA 时，在琼脂糖胶上有RNA 亚基二聚体存在，而用RNaseP 催化同一反应时，则未能检出这种二聚体。更早一些的实验还发现，在高Mg2+浓度下，聚乙二醇(PEG)可提高RNaseP 的RNA 亚基的催化活性，说明PEG 可促使RNA 亚基二聚体的形成，并且RNA 亚基在PEG 或蛋白质的不同存在条件下，其催化反应中的自身构象亦不相同。

Altman 等在研究RNA 亚基3’端5’端核苷酸缺失与其催化活性关系中，发现随3’端5’端不同核苷酸数的缺失，RNA 亚基的催化活性亦随之而降低，乃至失活，这说明RNA 亚基分子折叠所形成的三维空间结构可能是其催化活性的重要保证。

大肠杆菌的4.5sRNA 前体可被RNA 亚基剪切，但如果当有蛋白质亚基存在时，则剪接速度可加快几百倍以上。另外，RNA 亚基对3’端带CCA 顺序的前体tRNA 比对3’端CCA 顺序缺失的前体tRNA 的裂解效率更高，但当有蛋白质亚基存在时，则剪接这两类前体tRNA 的效率几乎相同，这说明蛋白质亚基决定着RNaseP 全酶对不同底物的剪接效率，可能对RNA 亚基功能起着某种调控作用。

到目前为止，已充分肯定了RNaseP 的催化活性中心在RNA 亚基上，但有关

RNaseP 与前体tRNA 的识别位点及剪接机制还不完全清楚。

(二) 四膜虫rRNA 前体的自我剪接

1981年Cech 发现原生动物嗜热四膜虫的大核26srRNA 基因中有一段内含子，该基因转录产物——前体rRNA 中相应于这段内含子的核苷酸顺序是一个有413个核苷酸的居间序列(IVS)。在前体rRNA 加工过程中，这个IVS 可自我催化切除，并最后使5’外显子与3’外显子连接成成熟的rRNA 分子。

在离体条件下，四膜虫大核rRNA 前体可在没有蛋白质存在下，由Mg2+和鸟苷或5’鸟苷酸作辅助因子，完全催化剪接过程。

为了证明剪接过程中，确实没有蛋白质参与，曾用重组DNA 技术得到四膜虫rRNA 基因中的413bP 连同两侧的DNA 克隆片段，将其离体转录出相应的RNA ，再进行SDS-酚抽提，以保证转录产物前体rRNA 不与酶蛋白结合，在电泳图谱上可看到环状IVS ，线状IVS 和缺失15个核苷酸的线状物3条谱带，结合其他一些实验结果，可以充分肯定前体rRNA 可在非酶蛋白质存在条件下进行自我剪接。

四膜虫rRNA 前体的自我催化剪接过程是由两步转磷酸酯反应完成的，反应中，不需要外源ATP 或GTP 提供能量。首先，在Mg 2+存在下，鸟苷或5’鸟苷酸的3’—OH 作亲核试剂攻击IVS 的5’—剪接位点，使鸟苷或鸟苷酸的3’—OH 与IVS 的5’—磷酸共价连接，之后，5’—外显子中3’端的羟基作亲核试剂攻击IVS 的3’—剪接位点，经转磷酸酯反应使5’—外显子通过UpU 共价相连，得到成熟的rRNA ，切除的IVS3’端鸟苷的3’—OH 攻击IVS5’端邻近的磷酸二酯键，使IVS5’端的15个核苷酸片段缺失，而形成一个由3’—5’磷酸二酯键相连的环状分子。

通过核苷酸顺序分析，发现四膜虫大核rRNA 前体的IVS 有6段保守顺序为：(5’)qR′—A —B —qL —qR —2(3’)，而且，A 与B ，qL 与2，qR 与qR’相互配对，使IVS 折叠成一定的二级和三级结构，结合IVS 内的位点专一突变或小段缺失和与IVS 互补的寡聚脱氧核苷酸以及高温、高浓度变性剂都将导致IVS 催化活性的丧失等事实，说明IVS 的催化活性可能由其自身的某种特定的精确三维空间结构所确定。

Cech 等(1986年) 进一步研究证明四膜虫大核rRNA 前体自我剪接后所形成的环状IVS 可水解成一个比完整IVS 少了5’端19个核苷酸的线状IVS 称为L-19IVS ，在离体条件下，L-19IVS 可催化五聚胞苷酸形成多聚胞苷酸，说明L-19IVS 具有核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、磷酸转移酶、酸性磷酸酯酶和RNA 限制性内切酶等5种酶活性。

对大量真核生物RNA 前体的剪接方式进行研究的结果表明，有许多RNA 前体的剪接并不需要酶蛋白质参与，而由IVS 自我催化完成，根据这些IVS 的结构及剪接方式，可将这些RNA 分为两类。第一类，IVS 结构与四膜虫大核rRNA 前体的IVS 相似，剪接方式也一样，反应需要鸟苷或5’鸟苷酸和Mg2+作辅助因子。

第二类，IVS 的结构不同于第一类，剪接时不需要鸟苷或5’鸟苷酸，但需要Mg2+参与反应，最后使IVS 形成套索结构而被除去。

鉴于以上两位科学家Cech 和Altman 对RNA 催化功能研究的卓越贡献，他们获得了1989年的诺贝尔化学奖。

RNA 催化功能的发现使人们对生物催化反应、酶的本质以及RNA 功能的多样性的研究进入了一个新天地。现在，又相继发现植物病毒RNA 、大肠杆菌T4噬菌体mRNA 的自我催化剪接作用。RNA 的催化反应还有许多问题需要进行更深入地研究。

参考文献：

1. 《Ribozyme ──具有催化功能的RNA 》 王慧阳

2. 《RNA 的催化功能》 王中银

3. 《四膜虫RNA 自身拼接与底物鸟苷间特异性相互作用——RNA 具有生物

催化作用》 《 医学分子生物学》 1985年05期