组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

$) 卷) 期

$’’! 年$%月生物工程学报! " #$%&%’() *$+, (#(/%0" $(, (-. 12S 6@T $)06T ) L . *6D 9:$’’! " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

周江邓继先刘红! 程萱卢一凡黄培堂

（军事医学科学院生物工程研究所北京$）%%%&$

摘要组织纤溶酶原激活剂（是一种较理想的溶血栓药物，本研究采用其突变体———*+, ）

长效组织纤溶酶原激活剂（-的. 将它插入羊! 乳球蛋白（1基, *+, ）/0, 作为目的基因，-2）(

因起始密码之前，使-翻译受控于1、序列，再将所构建的1, *+, 的转录、-2基因的34#4-2(

经点杂交筛选和5获得

基因整合阳性鼠，并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的-表达水平$／, *+, 表达，=3>"

。在这两只转基因鼠的’只A 有3只是阳性的，／? @$代子鼠中，*+, 表达水平维持在$#"

，能稳定地遗传给子代。? @1-2(*+, 融合基因整合到小鼠基因组，

关键词乳球蛋白组织纤溶酶原激活剂，转基因小鼠，羊! (

学科分类号B&! ’

［］目前利用转基$’! 3年，-6C 9@@(D E F 9$首次提出用转基因动物乳腺生产重组蛋白质，>

因动物作为生物反应器生产重组蛋白已引起广泛兴趣，转基因动物乳腺生产重组蛋白具有产量高、费用低的特点，并且对表达产物具有翻译后修饰与加工能力。人组织型纤溶酶

，对纤维蛋白有较强的亲和力，可选择原激活剂（G 7? E ; *H I I 79J @E I ? H ; 69; E . *H C E *6:*+, ）>

［］

半衰期短、临床用量大的特点，而且*+, 在K G L 细胞中的表达水平难以达到中试规模。

（-，因此，我们建立乳腺定位表达长效*+, 6; 9:E . *H ; *H I I 79@E I ? H ; 69; E . *H C E *6:-, *+, ）>>J >

突变体转基因小鼠，探索用转基因动物乳腺生产-, *+, 的可能性。本项工作采用我所刘

［］士辉、黄培堂等构建的-, *+,. /0, 为材料进行了深入研究#，-, *+, 具有+, M N $活

性，在与纤维蛋白亲和力未受损害的同时，特异性提高约) 半衰期延长$倍；我们利" O 、

用羊! 乳球蛋白（，基因的两端侧翼序列作为调控元件构建乳腺中表((@E . *6@6D 7@H ; 1-2）>! ［］采用显微注射的方法建立转*为今后大型动物的表达达-, *+, 的载体) ，+, 基因小鼠，

奠定了基础。

! 材料和方法

! " ! 实验材料

、，含1为本室保存。

国家! " #计划资助项目。

北京$。! 中国医学科学院心血管病研究所，%%%#&

，修回日期：。收稿日期：$’’&(%’($%$’’! (%) ($"

-期周江等：

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达+J +含有改构的突变体! () *+由本所刘士辉提供。" #$%&#的质粒’

! " ! " #限制酶及主要化学试剂：限制酶、, -连接酶等均购于中国华美生物工程公司及

透明质酸酶，丙酮酸钠等均购自美国6" . /013公司。化学试剂：4*5乳酸钠，703公司；22

牛血清白蛋白购于华美公司；其它葡萄糖，氯化钙等均为国产分析纯试剂。孕马血清促性腺激素（" 购于天津实验动物中心；人绒毛膜促性腺激素（:购自上海生物制药869）; 9）

厂；按

端扩增引物由本所合成：! " ! " $羊? @9基因>A

引物) ：>A , 9; #, 9; 9; ; , 9; , 9, #, ##+A

引物=：>A , #9#, ; , ; 9#9; , 9; #9; , 9999, ; 9, 9+A

! " ! " %实验动物：昆明白小鼠由本院实验动物中心提供。

（日本尼康），显微操作仪（日本岛津），拉针仪（日本岛! " ! " &实验仪器：倒置相差显微镜

, 8津），解剖显微镜，二氧化碳培养箱（&，常规手术器械，#" ; B ）87C 7; $E 1. " ; F 仪。D

! " #实验方法

感受态的制备，转化，依照《分! " #" ! 质粒%&#的提取，%&#的连接，%&#片段的回收，

［］4子克隆实验手册》进行。" ，，; F 扩增的循环条件为：G -H 变性+*I 4) H 退火) >I J =H

。+*I

注射时间为) ：，! " #" #取卵：供体鼠腹腔注射*K ) 0E" 869，=**-

:; 9。注射:; 9后分别将每只供体母鼠放入种公鼠笼内。超排时间一般为注射:; 9后) 。将有阴栓的供体母鼠挑出，引颈处死，取出两侧输卵管，置于含8*! ) +L =的培养皿中，解剖镜下将输卵管壶腹部撕开，将卵轻轻拨出，加入透明质酸酶（*／）。用K +00E 2

转入8放入; 8=洗-次后，) 4培养液，B =孵箱中。

烤平断口；用拉针仪拉! " #" $受精卵的显微注射：持卵器拉成*0直径的细管，"

成针尖约) 石蜡油覆0直径的注射针。在凹玻片上各滴上8=培养液和%&#注射液，"

盖。低倍镜下将注射针吸入适量的%受精卵注入8注&#注射液，=液滴中。高倍镜下，射针针尖刺入受精卵雄原核中，将%，可见雄原核膨胀，迅速抽出注射&#液注入约) ’E

针，卵注射完毕后，立即将卵转移至8。将受精卵从) 4培养液中，; B *07C =孵箱培养+

再吸入移卵管中，在解剖镜下找到输卵管伞开口，将移卵8) 4培养液移置8=培养液中，

管插入伞部后将卵吹入，手术完毕后缝合切口。

，即可用于提取%《分子克隆实验手! " #" %鼠尾%&#的提取：仔鼠出生) *M &#。按照

册》进行。

+=端引物作为探针，! " #" &点杂交筛选转基因鼠：利用设计的扩增? @9基因>A #N " M #, "

标记，鼠尾%杂交按《分子克隆实验手册》操作。&#点膜、

! " #" ’6/O ! L 1. C 杂交鉴定转基因阳性鼠：鼠尾%&#用P $/F Q +J H 酶切过夜，6/O ! L 1. C

+=转印按分子克隆手册操作，洗膜温度4端探针用#A N " M #, " 标记。

用双蒸水) 离心去乳脂，! " #" (阳性鼠乳汁中! " #活性测定：采取母鼠乳汁，*倍稀释，

［］采用纤维蛋白R 琼脂糖R 平板法测定! " #溶纤活性J 。

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图! " #$%&’() 酶切鉴定图谱

*+-! . /01’+2+34’+5152#$%&’() , "

（）：，，，，；4-6478079:; >; ; :; =@@41/! =@"

；9-#$%&’()/+0A ’0/B+’C D C . 41/#E . . " , " ,

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) B +’C6E J . "

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R I 975A O

U Q Q Q G +300I 975A . 103’0/0I 975A P 741A E 41’0/0I 975A 6+30527030’576+30529+7’C (5A A +’+T 0I +30O S O " O " " =Q Q Q ::Q ? U ; :

正常小鼠基因组F 因此我们用#端G ) 中没有#$%基因及其调控序列，$%基因; L

=! 用斑点杂交对=(M K 扩增的@>9&&(/) P (标记，:只小鼠的基因组" 片段作为探针，

初步获得=只阳性鼠。为排除假阳性结果，接着进行了D F G ) 进行筛选，5J ’C 071印迹鉴

定，显微注射所用#$%&$) ’() 融合基因F G ) 序列采用R 35K . 酶切可以切下含有#$%; L 端的; 用#端(89片段，$%基因; L M K 扩增的@>9D 5J ’C 071杂交结果有! 只" 作为探针，

鼠出现阳性带（图=），说明这! 只鼠是#$%&$) ’() 转基因阳性的。

! " :阳性鼠表达产物的检测

其乳腺中应表达目的基因，#$%&$) ’() 转基因小鼠作为一种乳腺生物反应器模型，

未转基因的正常小鼠乳汁中不含’将! 只阳性小鼠合笼（一雌、一雄），产仔:存() ，:只，活>只，对哺乳期阳性雌鼠麻醉取乳汁:，离心去乳脂，采用纤Q E :Q 倍稀释，:Q E 点样量，’’

维蛋白V 琼脂糖V 平板法测定’() 溶纤活性。有活性的’() 能激活纤溶酶原成为纤溶酶，纤溶酶能消化琼脂糖平板上的纤维蛋白，形成透明圆圈，通过对比透明圈的大小可测定’／（图

的蛋白的加工正确，生产出具有生物活性的’() 产物。

期周江等：

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达