酿酒酵母高密度有氧发酵条件的研究

酿酒酵母高密度有氧发酵条件的研究

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■赵小丽1，甄玉国1，王兰惠1陈

雪1

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林长春1301182.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

摘要：以甜菜糖蜜为唯一碳源筛选酿酒酵母高密度有氧发酵条件，以实验室选育的酵母菌为试

验用菌株，通过单因素和正交试验，优化实验室摇瓶发酵的条件，优化后的培养基为12%糖蜜,培养条件为温度30℃、初始pH值5.0、接种量4%、培养时间48h、装液量1/5(v/v)、转速180r/min，在此培养条件下菌体干重可达到9.63g/l。

关键词：甜菜糖蜜;酵母菌;发酵条件doi：10.13302/j.cnki.fi.2015.Z1.014中图分类号：S816.32文献标识码：A文章编号：1001-991X（2015）Z1-0050-05

Studyonhighdensityaerobicfermentationconditionsofsaccharomycescerevisiae

ZhaoXiaoli,ZhenYuguo,WangLanhui,ChenXue

Abstract：Yeaststrainsellectedinlabwasusedastheteststrain,beetmolassesascarbonsourceoffermen⁃tationtoproduceyeastbody.Laboratoryshakingflaskfermentationconditionswereoptimizedbythewayofsinglefactorandorthogonaltest.Theoptimizedmediumis12%molasses,cultureconditionsaretempera⁃ture30℃,initialpH5.0,inoculabilityquantity4%,incubationtime48h,fluidvolume1/5(v/v),revolutions180r/min.Drycellweightcanreach9.63g/lundertheculturecondition.Keywords：beetmolasses；yeast；fermentationconditions糖蜜是糖厂的副产物,产量很大，糖蜜不仅含糖酵母。量高而且还含有丰富的无机盐及各种生长因子,是酵1.1.2试剂与仪器设备母可以利用的可发酵性糖。因此利用糖蜜来生产饲甜菜糖蜜（拜泉飞雪制糖有限公司）参照酸化水料酵母不仅能提高糖蜜的附加值而且还可以充分利解法（张克旭，1992）进行糖蜜预处理，试剂均为国产用废弃物,有效地保护环境,降低饲料生产企业的成分析纯。葡萄糖、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨为生化试本。饲料酵母所含有的营养物质极为丰富，酵母含有剂，pHS-2C型数字式酸度计（上海SANXIN）；电子天易被畜禽吸收的必需氨基酸、B族维生素、矿物质元平（METTLERTOLEDO）；岛津UV-1201分光光度计素和微量元素等成分，是饲料蛋白质的有效补充物，（日本岛津公司）；Eppendorf5810R高速冷冻离心机作为蛋白质饲料添加到配合饲料中，具有和鱼粉相同（德国艾本德股份公司）；数显恒温水浴锅（泰特）、的功效（王定昌等，2002；刘晓兰等，2002）。本实验通YP1200型电子天平（上海精科实业有限公司）。过单因素和正交试验设计，研究以甜菜糖蜜为碳源发HYG-型培养摇床（上海欣蕊自动化设备有限公司）、酵生产高生物量酵母的培养条件的最优组合，为工业SPX-150型生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公化生产饲料酵母提供试验依据。司）、SW-CJ-IF型洁净工作台（苏净集团苏州安泰空

气技术有限公司）。1材料与方法

1.1.3培养基1.1材料

酵母斜面培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵1.1.1供试菌株

母浸粉10g/l，琼脂15g/l，121℃、0.1MPa灭菌20min。实验室前期试验获得经分子生物学鉴定为酿酒

酵母液体种子培养基（YPD培养基）葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，121℃、0.1MPa灭菌20min。1.2方法

1.2.1菌株活化

无菌条件下接一环保藏菌种至YPD斜面培养基，30℃培养48h

复苏菌种。

50

2015年第36卷第1期增刊

1.2.2生长曲线的绘制

将斜面保存的优势菌株挑取一环接种于500mlYPD培养基中，装液量2/5（500ml三角瓶装200ml培养基），在水浴摇床中30℃、180r/min培养，每隔两个小时在无菌操作条件下取样，在560nm波长下测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制生长曲线。1.2.3种子扩大培养

取一环活化后的斜面菌种，转接到装液量为100ml/250ml的种子培养基中30℃、180r/min培养24h。1.2.4单因素摇瓶发酵初始条件

培养基初始pH值5.0、培养基装液量1/5（20ml/100ml三角瓶），30℃、180r/min摇床培养24h。1.2.5菌体密度测定

用紫外可见分光光度计在560nm波长下测定吸光度值即OD值。

1.2.6菌体生物量测定

发酵液5000r/min离心10min，蒸馏水洗涤2次后收集菌体，105℃烘干至恒重，称量并记录数据。1.2.7单因素试验

培养基选取糖蜜浓度、氮源、无机盐、生长因子,培养条件选取pH值、温度、接种量、培养时间4个因素研究其对菌株生物量的影响。1.2.8正交试验

根据单因素试验结果，选取对菌体生物量影响较大的因素设计正交试验，研究发酵条件的最佳优化组合。1.2.9试验数据采用SpSS17.0软件，Duncan's进行方差分析。

从图1曲线上看，这株菌在0~6h处于延滞期，6~18h处于对数生长期，18~30h处于稳定期随着培养时间的延长部分菌体开始死亡，由于死亡的菌体和活的菌体不能够分离开来，所以在生长曲线上看不到菌的衰退期，而且在稳定期时，从总的吸光度值上看，是略呈增长的趋势，只是涨幅很小。因此当制备种子液的时候在同样培养条件下，培养到20h左右即可。2.2培养基单因素筛选结果

2.2.1糖蜜浓度对菌体生物量的影响（见图2）

191817OD值

[1**********]0

糖蜜浓度（%）

图2糖蜜浓度对菌体生物量的影响

2结果与分析

2.1种子液生长曲线的绘制（见图1）

161412OD值

108642

0时间(h)

图1生长曲线

从图2分析，随着糖蜜浓度的增加，吸光度值也随

之增加，当糖蜜浓度达到12%时增长变缓，经方差分析12%与14%两组间差异不显著（P>0.05），所以糖蜜浓度选为12%，从糖蜜对菌体生物量的转化率和经济成本的角度考虑，高浓度糖蜜转化率低，另外从糖浓度对酵母菌增值的影响，高浓度糖在酵母增殖到稳定期时比低浓度糖过早表现出糖抑制作用，可能是因为高浓度糖使酵母菌能够快速达到对数期，伴随酵母菌快速增长的同时，代谢产物也快速积累，一些有抑制作用的代谢物快速达到其发挥抑制作用的浓度，从而阻碍酵母菌的增值，相对初始糖浓度来说增大了残糖量，造成原料的浪费，增加了投入成本，所以综合以上各因素本实验选择12%的糖蜜浓度作为适宜的碳源浓度。2.2.2不同氮源对菌体生物量的影响（见图3）

由图3可以看出，与对照组相比较，添加硫酸铵和尿素对菌体生物量的增加没有起到正向作用，反而略有点抑制，蛋白胨组与对照组相比较生物量略有提高，经单因素方差分析，

差异不显著（P>0.05），考虑到蛋白胨的成本和对菌体生物量增加的幅度，本试验选择不添加蛋白胨。

51

1918.818.618.418.218

2221.5OD值

21

OD值

20.520

空白硫酸铵尿素蛋白胨图3

不同氮源对菌体生物量的影响

图5

0.010.050.10.15添加浓度（%

）

硫酸镁不同添加量对菌体生物量的影响

空白

2.2.3磷酸二氢钾不同添加量对菌体生物量的影响（见图4）

2019.519OD值

18.51817.517

2.2.5氯化钠不同添加量对菌体生物量的影响（见图6）

2019.5OD值

19

18.518

空白

空白0.010.050.1

图6

0.050.10.15

添加量（%

）

氯化钠不同添加量对菌体生物量的影响

0.01

图4

添加量（%

）

磷酸二氢钾添不同添加量对菌体生物量的影响

由图4可见，随着磷酸二氢钾添加量的增加，菌体生物量呈现逐渐下降的趋势，经单因素方差分析0.01%、0.05%组与空白组之间差异不显著（P>0.05），0.1%组显著低于空白组（P

2.2.4硫酸镁不同添加量对菌体生物量的影响（见图5）

由图5可见，随着硫酸镁添加量的增加，菌体生物量呈现下降趋势，并且经单因素方差分析空白组与0.01%组的菌体生物量差异不显著（P>0.05）,但是空白组显著高于其余3组（P

52

由图6可见，随着氯化钠添加量的增加，菌体生物量呈现下降的趋势，可能是随着氯化钠添加量的增加使得培养液的渗透压增大，酵母菌只有在适宜渗透压的溶液中才能正常生长,所以不添加氯化钠。

2.2.6酵母浸粉不同添加量对菌体生物量的影响（见图7）

由图7可见，随着酵母浸粉添加量的增加，菌体生物量呈现下降的趋势，可能是因为本身培养基中的各种营养因子的含量就能满足菌体生长的需要，额外再加入使得含量过高反而出现了抑制效果，因此培养基中不需要添加酵母浸粉。

2.2.7渗透压保护剂甘氨酸不同添加量对菌体生物量的影响（见图8

）

2015年第36卷第1期增刊

2019.5OD值

19.619.419.219

空白

0.01

0.05

0.1

高，说明其菌体生物量最大，经方差分析pH值5.0组与pH值6.0组差异不显著（P>0.05），考虑到培养液的初始pH值低一点，使培养液偏酸性能够抑制杂菌的生长，因此选择初始pH值为5.0。2.3.2

最适培养温度对菌体生物量的影响（见图10）

2120OD值

1918171615

图7

2120.5OD值

2019.51918.5

添加量（%

）

酵母浸粉不同添加量对菌体生物量的影响

温度（℃）

图10不同培养温度对菌体生物量的影响

由图10可见，当培养温度为30℃时菌体生物量最高，随着温度的升高菌体生物量开始下降，因此最适宜的培养温度选择为30℃。

空白

0.2

0.4

0.6

图8

添加量（%

）

甘氨酸不同添加量对菌体生物量的影响

2.3.3接种量对菌体生物量的影响（见图11）

2019.819.6OD值

19.419.21918.8

由图8可见，随着甘氨酸添加量的增加，菌体生物

量呈现逐渐下降的趋势，因此培养基中不添加甘氨酸。2.3在培养基筛选的基础上对培养条件进行单因素筛选

2.3.1培养基pH值对菌体生物量的影响（见图9）

1918.5OD值

18

接种量（%）

图11不同接种量对菌体生物量的影响

从图11可见，看随着接种量的增加，菌体量呈现下降趋势，经方差分析，2%与4%的接种量之间差异不显著（P>0.05），而4%的接种量与其余各组比均显著高于各组（P

17.517

2.3.4培养时间对菌体生物量的影响（见图12）

图9

pH值

不同初始pH值对菌体生物量的影响

从图12可可见，随着培养时间的延长菌体生物

量也随着增长，培养时间为72h时菌悬液吸光度值高，经方差分析48h和72h菌体生物量差异不显著（

P

53

从图9可见，当初始pH值为6.0时菌体生物量最

[1**********]615

培养条件下提高6%左右。

3结论

酵母菌是一类单细胞微生物，具有个体大、易分

OD值

离、易培养、蛋白质含量高，代谢产物多等特点，在蛋白饲料严重不足的今天，酵母及其培养物的广泛应用，对我国畜牧、饲料生产有重大意义。本文对供试菌株进行了培养基配方及培养条件的研究，首先通过

时间（h）

不同培样时间对菌体生物量的影响

单因子试验，确定培养基为质量分数为12%的糖蜜，通过单因素试验确定最佳的培养条件为培养基初始培养温度为30℃、经正交试验优化后的培养条件为pH值5.0、培养温度30℃、接种量4%、培养时间48h，比初始培养条件下提高6%左右。

参考文献

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于景芝．酵母生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，胡敏，朱明军，刘功良，等.甘蔗糖蜜废水生产饲料蛋白质的研究2005．

图12

2.4正交试验

pH值为5.0、接种量4%、培养时间48h，酵母菌的适宜

根据单因素试验结果，选取培养温度、发酵液

pH值、接种量培养时间4个因素设计正交试验采用

4

L（的正交设计表（见表1）。93）

在此优化后培养条件下酵母菌体干重可达到9.63g/l，

4

4

刘建静,杨曙明,宋海彬.单细胞蛋白饲料的开发与利用[J].黑龙江畜牧医,2008（4）：21-22

郭壮，白梅，张和平，等.利用甜菜糖蜜生产单细胞蛋白的研究[J].粮食与饲料工业，2008（9）：

36-38、45.

[J].中国饲料，2006（17）：36-39.

由表2可知，RA>RD>RB>RC即pH值对菌体生物量的影响最为显著，然后依次为发酵时间、培养温度、培养温度30℃、接种量4%、培养时间48h，在此优化后培养体系条件下,酵母菌体干重可达到9.63g/l，比初始

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接种量，其最佳发酵条件组合为A2B2C2D2即pH值5.0、

（编辑：王

芳，[email protected]）