ELISA检测甲胎蛋白试验精密度的评价

医学免疫学实验设计

ELISA检测甲胎蛋白试验精密度的评价

一、 试验原理

1、双抗体夹心一步法测AFP：在微孔上包被纯化的甲胎蛋白抗体（抗AFP），同时加

入待检血清和酶标抗体（抗AFP—HRP），血清中AFP抗原与微孔上抗AFP和酶

标抗体结合，洗涤分离后，加入酶底物系统，留在微孔表面的抗AFP—AFP —抗AFP—HRP夹心复合物中的HRP催化底物进行显色反应，其颜色（黄色）的深浅（吸光度A高低）与血清标本中AFP含量呈正相关。显色为阳性，不显色为阴性。

2、精密度是分析过程中重复性的指标，不能用数字表示，可用数字表示的是其反义概

念—不精密度，用在相同条件下，对同一样品多次测定（20次）实验结果的标准差（S）或变异系数（CV）表示，其值越小表示ELISA试验的精密度越好。（CV至少小于15%）

二、 试验仪器与试剂

仪器：洗板机、酶标仪、微量加样枪、恒温水浴箱、吸水纸（卫生纸）、 消毒缸、洗瓶、

记号笔

试剂：高浓度（400 ug/L）和低浓度（25 ug/L）AFP血清各2ml，蒸馏水，抗AFP包被

的微孔板、AFP Ag阳性对照、AFP Ag阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液、封板膜

三、 试验方法

四、 试验结果判断

若阳性对照孔为黄色，阴性对照孔和空白孔为无色，则阴阳对照可用；样品孔均为黄色（低浓度AFP组较高浓度AFP组色浅），此时可利用样品孔吸光度值对ELISA进行精密度的评价。

五、 试验结果计算及统计学处理

CV=（S/A）S*100%

AA

i

i1

n

2

n1

分别计算出高浓度组、低浓度组实验结果（各孔样本的吸光度值）的平均值A、标

准差S和变异系数CV，用于评价ELISA试验的精密度，标准差S和变异系数CV越小

表示ELISA的精密度越好。 六、 质量控制

1、 室内质控：必须设置3孔阴性对照、2孔阳性对照、1孔空白对照，从而保证本试

验的可信度。

2、 血清应提前30分钟从冰箱取出，恢复至室温，使用前先混匀，且血清应为无溶血、

无黄疸、无细菌污染的阳性血清，避免反复冻融；样品的浓度应为已知的准确浓度，避免超出检测范围。

3、 选用最佳的试剂盒，且试剂盒应提前30分钟从冰箱中取出恢复至室温，微孔板开

封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

4、 检测之前，将洗板机、酶标仪、恒箱、加样器等认真校正、调试。

5、 向微孔内添加样品和任何试剂时，应该垂直加入，并轻轻振荡混匀。且所有微孔添

加完成的时间应该尽可能短。

6、 加样枪的使用应该正确规范化，吸液时吸头不应插入液体过深，应在液面下

2—3mm处，移取不同液体时必须更换新的吸头。 7、 温育时所用的封板膜应无污染一次性使用，温育的时间要合适，恒温箱中的水位应

该合适，避免温育不均匀。

8、 洗涤时应有30 S的浸泡时间，每孔应加满洗涤液，但要注意每个微孔的洗涤液不

能溢出到另外的微孔，手工洗涤时每次应尽量拍干水分，洗板结束后，立即进行下一步，避免微孔干燥，使酶失活。

9、 在加显色剂时要准确，避免溅出孔外，加显色剂时间要越快越好

10、使用酶标仪时，应擦干微孔板的底部且避免接触底部外壁，孔内不能有气泡。 11、处理数据时，先去掉离散值再计算。 12、选择素质最好、操作最熟练的学生进行认真地专门测定，整个实验过程严格控制每

步反应温度和时间，操作应紧凑。

七、注意事项和影响因素

1、标本和质控品禁用叠氮钠作稳定剂，确保病人样本、定标物、质控物在测试前温度达到室温18-25℃。

2、所用ELISA试剂盒必须为同一厂家、同一批次，不同厂家和不同批次的试剂不能混合使用。

3、手洗扣干时，力度要适当，避免扣坏微孔板。

4、使用酶标仪在计算机上设置相应孔位时，应一一对应，避免混淆。

5、实验结束时，没有使用完的试剂盒应该及时放回冰箱冷藏，且在试验过程中避免污染。

6、使用硫酸终止液时注意安全。

7、试验的所有样品、试液和废弃物应该正规处理。

8、显色后加入终止剂后最好立即（最好10min内）测定A值。

9、显色剂的量必须准确，并且次序为先加显色剂A，再加显色剂B。

10、标本采集后最好在24小时内测定。分离的血清可在2~8度保存，但不超过七天，若

长时保存在-20度以下，应避免反复冻融。

11、在最后结果判断和A的测定时，前提条件是阴阳性对照可用的情况，如果阴阳性不

可用，即阴阳性对照无效，则本实验无效，不能用于ELISA精密度的评价。