液相色谱--比例阀及混合

对于一个梯度洗脱液相而言,所有性能中最重要的其实是系统能否产生精确的线性梯度。因此对系统进行足够详细的梯度验证测试是十分必要的。这是个简单的测试,你需要一瓶HPLC 级的纯水放在A 瓶中和含0.1%丙酮的纯水放在B 瓶中。然后取下色谱柱,用一节细管子代替连接到色谱系统中,流速设置为2mL/min以产生足够的背压使单向阀能可靠地工作,最后将检测器的检测波长设置为265nm 。

如果是双元泵的高压混合系统,只需做两个测试。第一,以10%增量(0%B,10%B,…,100%B)测试,每个比例保持3min ,中间额外插入45%B和55%B两个比例。实际值应在理论值的1%范围内(标准可自由定义)。

第二,设置一个15min 的梯度变化(0%B-100%B)。结果应是一条直线。

如果是低压混合系统,需要加上一个测试以验证各通道的性能。做法是将A 、B 连接至A 瓶,C 、D 连接至B 瓶。然后以

50:50AB - 90:10AC - 50:50AB - 90:10AD - 50:50AB - 90:10BC -50:50AB - 90:10BD - 50:50AB走梯度,每个梯度保持2min 。一个良好的四元比例阀最后应得到四个高度相近的矩形峰,每个高度相对于平均值偏差应在1%以内(这个标准是自由定义的)。

从第二个测试,即梯度线性测试,我们可以很简单地计算系统的死体积。即是找到结果中50:50AB混合比例的时间,减去整个梯度线性变化总时间的一半(7.5min ),再以结果乘上流速即可知道系统的死体积。

了解了比例阀的测试方法,接下来应该对比例阀本身有一个简单的认识。

比例阀在Waters2695中称为“梯度比例阀”(Gradient Proportioning Valve,GPV ),水平放置于溶剂托盘中,如下图:

Agilent 1100

中称为“多元梯度阀”(Multi-Channel Gradient Valve ,MCGV ),垂直放置于G1311四元泵中,位置如下:

由于垂直放置,在使用缓冲盐时,建议将水相(含缓冲盐)置于下面的两个通道中(通常为A 和D 通道)。其造型和内部结构如下:

AGILENT 的比例阀使用红宝石配合两个弹簧用于通道的密封。在不通电时,电磁阀内的弹簧较为强劲,将红包石压在阀座上,通道关闭;当通电时,磁体被磁场往下吸,阀座下面的小弹簧则把红宝石和顶开,通道打开。

Waters 的比例阀的关闭和打开则使用一体式的设计,其电磁阀阀芯、隔开电磁阀和GPV 阀体的薄膜以及密封通道的堵头被固定在一起。在不通电时,电磁阀内的弹簧将堵头压在通道的小孔上,通道关闭;当通电时,堵头和阀芯一起向后运动,通道打开。

Waters 和AGILENT 的四元比例阀都属于常闭式设计,在不通电时通道关闭。

通过以上设计即可理解为什么AGILENT 的比例阀故障率较Waters 的高。

四元比例阀的比例控制方式基本都是相同的,即在一个柱塞杆的冲程内,根据方法条件分

配各个通道的打开时间。比如A 相和B 相按60:40的比例混合,则在一个柱塞杆冲程的时间内60%的时间A 通道打开,40%时间B 通道打开。由于比例阀的打开和关闭都有一个最小时间间隔(5ms 或者更多),所以事实上一些极低的比例(比如0.5%)是无法达到或稳定维持的。

二元泵的梯度方式并不是通过比例阀进行控制,也不是通过溶剂选择阀

(Solvent Selection Valve,SSV ),而是通过控制两个泵的流速来实现比例控制。在二元泵中没有比例阀,而SSV 其实属于选配,SSV 的作用是允许使用者从四种流动相中选取2种运行色谱条件,主要是便于序列运行多种色谱条件时流动相的切换。比如系统流速设定为1mL/min,A 与B 以60:40混合,则A 泵将以0.6mL/min的速度输送A 相,B 泵将以0.4mL/min的速度输送B 相。当然实际情况可能会考虑到溶剂混合和溶剂压缩性能而变化。

我们可以看到溶剂虽然是按照设计的比例被抽取的,但并不是以设计的比例混合后抽取的,所以在之后的管路中,流动相的混合是一个非常重要的,混合效果会直接影响梯度洗脱保留时间的重现性以及基线噪音。

对于Waters2695,流动相的混合主要发生在两部分,一个是比例阀到柱子之前的所有连接管道,一个是泵内高压混合。对于泵内混合,我个人认为初级泵中的“预压缩”(在泵中会解释)步骤贡献最大。试想液体在初级泵中体积被压缩至原来的5/6左右,这能带来怎样的混合效果?当然之后的管道也能带来并维持一定的混合效果。

对于AGILENT 四元泵系统,流动相从MCGV 到泵再到Damper (阻尼器,同时有测量系统压力的作用)再经过自动进样器再到达色谱柱。

而其二元泵系统相比四元泵,又额外多了一个混合器。无论是Damper 还是混合器,其目的都是为了更好的混合效果,虽然这些都增大了系统体积。至于为什么二元泵还额外需要一个混合器,可以留在泵中讨论。当然也希望有朋友能先提出自己的见解,毕竟我的也只是一家之言。

关于混合效果的测试实验,我找到一个资料,自己没做过,希望有朋友测试一下,然后反馈过来。

实验条件如下:一根C18色谱柱,流动相A 为含0.1%TFA的水,流动相B 为含0.1%TFA

的乙腈,B 在35min 内从5%变化到40% ,流速为1mL/min,样品为10uL 水,在214nm 波长下采集数据,查看基线波动情况。

当然理论上要求采用同样的检测器,这对仪器有一定的混搭要求,不过从该资料提供的结果上看,混合不好的话,在B 比例比较低的时候基线噪音会比较大,然后慢慢好起来。

关于混合,静态混合器实际内部结构应该是多通道多截面,使流动相在静态混合器内充分混合,这样对紫外吸收敏感的溶剂而言,必然可以降低因混合不均儿造成的基线噪音问题。


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