凯氏定氮法测定灵芝破壁孢子粉中粗蛋白质含量的不确定度评定

　　对采用凯氏定氮法测定灵芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉中粗蛋白含量的不确定度进行评定，结果表明合成相对标准不确定度为0.02%，扩展不确定度为0.04%。在本次孢子粉粗蛋白质测定中，引入不确定度的主要因素有盐酸标准溶液的浓度及样品测定中实际消耗的标准溶液体积。　　凯氏定氮法； 灵芝破壁孢子粉； 粗蛋白质含量； 不确定度评定　　随着公众对食品和保健品品质的关注度不断提高，对产品质量检测提出了新的要求，对检测机构所提供结果的可靠性和可信度也希望能够有更多的了解和评价。为了不断提高测量技术水平，有必要对不确定度进行评定，分析不确定度来源，对测量结果不确定度影响较大的来源，给予足够重视并设法降低。灵芝（Ganoderma lucidum）孢子粉中粗蛋白质含量是其质量评价中的一个重要指标，本研究依据国家质量技术监督局标准［1］，对采用凯氏定氮法测定灵芝孢子粉中粗蛋白质含量的不确定度进行评定，分析影响不确定度的主要来源，为进一步提高检测技术水平和检测结果质量提供参考。　　1 材料与方法　　1.1材料　　灵芝（G. lucidum）破壁孢子粉为送检样品。　　1.2蛋白质含量计算　　蛋白质测定方法同参考文献［2］。　　孢子粉粗蛋白含量（X%）的计算公式如下：　　X=(V1-V0)×C HCl×0.014×6.25×100%m　　V 1：滴定待测试样时所消耗标准盐酸溶液的体积，mL　　V 0：滴定空白时所消耗标准盐酸溶液的体积，mL　　C HCl：盐酸标准溶液的浓度，mol/L　　m：待测试样的质量，g　　0.014：与1.00 mL盐酸标准溶液相当的以g表示的质量　　6.25：氮换算成蛋白质的平均系数　　1.3分析不确定度的数学模型　　采用凯氏定氮仪（2200型，瑞典FOSS公司）测定灵芝孢子粉中粗蛋白含量方法中的不确定度主要来源有以下四个方面：测量重复性（REP）；样品的称量质量（m）；滴定样品溶液实际消耗盐酸标准溶液的体积（V 1-V 0）；盐酸标准溶液的浓度（C HCl）。由于上述各分量相对独立，所以估算灵芝孢子粉中粗蛋白质的相对合成标准不确定度Ur（X）的数学模型同文献 ［3］：　　1.4测量重复性引入的相对标准不确定度　　按照标准GB/T15673-2009对灵芝孢子粉样品进行10次平行测定，空白体积V 0为 0.10 mL，盐酸标准溶液浓度为0.09652 mol/L，灵芝孢子粉中平均粗蛋白质含量X为11.55%。　　由测量重复性引入的标准不确定度，根据文献［1］公式计算：U（REP）=S(X)；则相对标准不确定度Ur(REP)=4.42×10-4。　　1.5样品称量质量引入的相对标准不确定度　　使用电子天平（AL204-IC型，瑞士梅特勒公司）称取样品，取样量平均为0.56 g，单次称量，天平最大允许误差（MPE）为±05 mg、四角误差为 -0.2 mg、重复性误差为0.1 mg，按正态分布考虑，K=3，则样品称量质量引入的标准不确定 度U(m)=1.83×10-4 g；相对标准不确定度 Ur(m)=3.27×10-4［3］。　　1.6滴定样品溶液实际消耗盐酸标准溶液的体积引入的不确定度　　1.6.1滴定管校准体积引入的不确定度　　滴定用50 mL A级滴定管（357号,购自上海市计量测试技术研究院)，滴定时所消耗的体积平均为7.84 mL，空白体积为0.10 mL，查357号滴定管检定证书（证书编号：D[1**********]），在0～10 mL 区间内给出修正值为0.016 mL，按三角分布，K=6［4］，则滴定管体积校准引入的标准不确定度U1(V1)=6.53×10-3;U1(V0)= 6.53×10-3。　　1.6.2温度变化补正引入的不确定度　　测定室温为236 ℃，滴定时溶液温度 220 ℃。滴定消耗盐酸溶液的体积平均为 7.84 mL，空白体积为0.10 mL，根据GB/T601-2002附表A-不同温度下标准滴定溶液的体积的补正值，滴定和空白体积补正值分别为 -3.14×10-3 mL和 -4.0×10-5 mL，按均匀分布K=3，则温度补正值引入的标准不确定度U2(V1)=1.81×10-3;U2(V0)=2.31×10-5。　　1.6.3不确定度的合成　　参照文献 ［5］，由上述两个方面因素合成的标准不确定度为：　　滴定样品所消耗盐酸标准溶液体积引入的不确定度为：　　1.7盐酸标准溶液浓度引入的相对标准不确定度　　用基准无水碳酸钠标定盐酸标准溶液浓度，按照GB/T601-2002对其标定，其计算公式为：　　C HCl-盐酸标准溶液的浓度，mol/L；　　m Na2CO3-称取无水碳酸钠的质量，g；　　V HCl-盐酸标准溶液消耗的体积，mL；　　P-无水碳酸钠的纯度；　　52.99-碳酸钠的摩尔质量，g/mol　　根据上述计算公式分析，盐酸标准溶液浓度的不确定度Ur（C HCl）主要来源于标定的重复性、基准物质的纯度、称量质量和标定体积。估算盐酸标准溶液浓度的相对合成标准不确定度 Ur（C HCl）的数学模型［6］为：　　1.7.1盐酸标准溶液浓度标定重复性引入的不确定度Ur（REP）　　标定盐酸标准溶液依据GB/T601-2002两人四标八平行重复，平均值分别为0.096490 mol/L和0.096543 mol/L，按照文献［3］公式,单次实验标准偏差分别为1.64×10-4和3.37×10-5，总平均值为0.09652 mol/L;按照文献［1］公式,合并样本标准差Sp 为1.18×10-4。以均匀分布考虑K=3，则其重复性引起的标准不确定度 U(REP)=6.81×10-5；相对标准不确定度 Ur(REP)=7.06×10-4。