新型细胞色素P450氧化酶的发现与筛选

214 中国医药生物技术 2011年6月第6卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2011, Vol. 6, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.03.009

·综述·

新型细胞色素P450氧化酶的发现与筛选

孙宜锋，方渡

细胞色素 P450 是一类被广泛研究的依赖于血红素的氧化酶，因它在还原状态下能与 CO 结合形成复合物，在 450 nm 附近有最大吸收峰而命名为细胞色素 P450[1]。P450 首先在哺乳动物肝微粒体中被发现。迄今为止，已经命名的 P450 有 12 000 多个。P450 广泛分布于真核生物和原核生物中，在内源和外源化合物的代谢中发挥重要作用[2]。P450 有较高的区域选择性和立体选择性，可以在比较温和的条件下在有机化合物中引入氧，催化一系列的反应，包括脂肪族和芳香族碳的羟化、有机氮和硫的氧化、环氧化以及 Baeyer-Villiger 氧化等。其中值得关注的是，一些 P450 酶可以催化一些活性较低的碳氢键的直接氧化，这类反应在化学合成中是比较难进行的。因此，P450 作为生物氧化催化剂引起了广泛的关注[3]。抗疟药物青蒿素（artemisinin ）是萜类天然产物的一种，在其生物合成途径中（图 1），反应的关键步骤是由 P450 氧化酶催化完成的，首先倍半萜 FDP 前体 1 经 4, 11-二烯合成酶的催化生成（2a ），之后经过 P450 氧化酶 CYP71AV1 氧化生成 artemisinic acid（2b ）[4]。

由于大部分 P450 酶的活性较低、寿命较短，选择的底物范围较小，其工业化应用还是很少，所以需要扩大 P450 酶库，通过大规模的筛选，拓展酶的底物适应性及选择性。在已有的 P450 酶库内，对功能和结构已知的酶，根据它们的晶体结构，人们通过定点诱变，以及随机突变定向进化，可以得到一些新的 P450 酶，再筛选具有特定功能的酶[5-6]；另一方面，随着生物信息学的迅速发展，越来越多的生物基因组序列被测定，这些基因组序列中包含了大量的 P450 基因，从这个巨大的基因组序列库中寻找新的 P450 引起了人们很大的兴趣。通过基因挖掘的方法寻找新的 P450 是目前比较常用的一种方法。

1 寻找新的 P450 氧化酶

根据氨基酸序列的同源性将 P450 归于不同的家族或亚家族，同源性大于 40% 的归为同一家族（如 CYP101），大于 55% 归为同一亚家族（如 CYP101A）[7]。通过与已知的 P450 进行同源性比对，可以推测基因序列编码的酶属于某一家族，并预测它可能的底物和功能，通过聚合酶链式反应（PCR ）直接克隆得到这些 P450 基因，在合适的宿主如大肠杆菌中高效表达就可以获得新的 P450 生物催化剂，而这些酶的底物特异性、产物选择性和催化转化率与已知的 P450 相似但不完全相同。利用这种方法，找到了已知的两个 P450、CYP102 和 CYP152 家族的新成员。 1.1 CYP102 家族成员的发现

CYP102A1 是在革兰阳性菌 B. megaterium ATCC 14581 中发现的，是研究的最广泛的 P450 之一。它是一个可以自给自足的单加氧酶，包含一个血红素结构域，一个双黄素还原酶结构域和它们的连接区域。这个独特的结构使其具有比其他 P450 更高的催化及转化效率。CYP102A1 利用 NADPH 作为电子供体，催化长链脂肪酸近末端位置的羟化，它对不饱和脂肪酸底物选择性高于饱和脂肪酸和支链脂肪酸[8]。CYP102A1 基因的同源基因，命名为 CYP102A2、CYP102A3、CYP102A5、CYP102A7，分别从 B.subtilis 、B.subtilis 、Bacillus cereus、Bacillus licheniformis 中鉴定出来。利用 Blast 程序分析表明，CYP102A2 和 CYP102A3[9]分别与 CYP102A1 有 59% 及 58% 的同源性，它们之间有 60% 的同源性，CYP102A2 对不饱和脂肪酸和支链脂肪酸的羟化活性比对饱和脂肪酸的羟化活性高，尤其是对支链脂肪酸的羟化活性比 CYP102A1 要高，而 CYP102A3 的底物选择性与 CYP102A2 相似，只是催化活性稍低[10]。CYP102A5 与 CYP102A1 有 60%

图 1 青蒿素的生物合成

作者单位：410208 长沙，湖南中医药大学药学院药化教研室 通讯作者：方渡，Email ：[email protected] 收稿日期：2011-03-14

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的同源性，它可以催化长链脂肪酸的羟化，而且催化活性非常高。此外，CYP102A5 的区域选择性比 CYP102A 家族其他成员更高。CYP102A7 与 CYP102A1 有 59% 的同源性，与其他成员不同，它对饱和脂肪酸的羟化活性比对不饱和及支链脂肪酸活性高，对环状萜类也有较高的羟化活性[11]。

1.2 CYP152 家族成员的发现

CYP152A1 是一种单组分酶，可以利用 H 2O 2 作为氧化剂，而不需要复杂的电子传递系统和昂贵的 NAD(P)H，有利于它的实际应用。CYP152A1 是基于与 CYP152B1 的序列相似性而在 B. subtilis 168 基因组序列中发现的[12]。与 CYP152B1 催化脂肪酸 α 位羟化不同，CYP152A1 催化饱和脂肪酸的 β 位羟化。它可能是酰基肽类抗生素合 成途径中的一个酶，因为这类抗生素中含有 β-羟基脂肪 酸[13]。基于与 CYP152A1 的序列相似性，在厌氧菌 Clostridium acetobutylicum A TCC 824 中发现了 CYP152A2。它与 CYP152A1 有 59% 的氨基酸序列同源性，可以利用 H 2O 2 为氧化剂，催化肉豆蔻酸 α 及 β 位的羟化[14]。 1.3 根据基因组序列分析发现新的 P450

在一些抗生素的生物合成基因簇中经常包含一些 P450 基因，催化其中某些重要的反应步骤，如埃博霉素和柔红霉素生物合成途径中就有 P450 发挥作用。随着生物信息学的迅速发展，很多菌株已经完成了全测序，利用在线软件（Blast ）分析基因组序列中的开放读码框，推测出基因组序列中包含的一些 P450 基因，这些基因编码的酶的功能是未知的，需要表达这些基因，再通过一些高通量的筛选方法确定它们的底物和活性，这样就确定了一个新的 P450，它们的底物选择性及功能都与已知的 P450 不同。Lamb 等[15]从全测序的Streptomyces coelicolor A3(2) 中推测出了 18 个 P450 基因，其中鉴定出 CYP105D5 可以催化脂肪酸羟化。Sakaki 等分析 Streptomyces griseolus 的基因中的 P450 体系，包括 CYP105A1，通过在 Escherichia coli 中表达以后分析发现，CYP105A1 可以催化 VD2 和VD 3 的 25 位羟化[16]。 1.4 我们的研究

我们根据分析基因组序列信息的方法，从新型抗肿瘤抗生素 Yatakemycin 的产生菌链霉菌 TP-A2060，生物农药金核霉素的产生菌链霉菌 Streptomyces 371 这两个本实验室进行全测序的链霉菌菌株中，分别发现了 19 和 18 个 P450 基因，利用在线软件分析这些 P450，把它们划分到不同的 CYP 家族。然后利用分子生物学克隆表达方法，在大肠杆菌中表达得到可溶蛋白，确立了菌株中的 P450 体系，并进一步研究他们的功能与活性。

效、合适的筛选方法与之配合才能鉴定得到新的 P450 氧化酶。根据 P450 库的大小和作为潜在底物的化合物的数量，有以下几种筛选方法可以检测 P450 的催化活性。 2.1 几种高通量的筛选方法

目前通用的检测方法是检测 NAD(P)H、氧气和过氧化物，这种方法适用于只检测氧化活性而不考虑底物的类型。NAD(P)H 在 340 nm 有吸收，检测随着底物的氧化 NAD(P)H 的消耗量，这种方法在酶的检测实验中经常应用[9]。Tsotsou 和他的同事建立了另一种方法：检测 NAD(P)+ 的产生量。这个方法是检测碱溶液中 NAD(P)+ 在 360 nm 的吸收，虽然在强碱溶液中 NAD(P)+ 的消光系数几乎和 NAD(P)H 是一样的，对活性较低的酶来说检测 NAD(P)+ 的产生量还是要比检测 NAD(P)H 的消耗量可靠[17]。检测氧气也是一种有用的方法，氧传感器已经用于 P450 的底物筛选中了，这种商用微系统利用的原理是钌染料的荧光在有氧气存在的条件下大幅淬灭[18]。另外，一些 P450 如 CYP152A1，利用过氧化物为氧化剂，可以利用比色法检测。最近，Rabe 等[19]建立了一种检测有机过氧化物的方法：以过氧化氢酶为指示酶，催化 Amplex Red 和有机过氧化物形成有荧光的化合物。 2.2 直接检测反应产物

与检测 NAD(P)H、氧气、过氧化物的方法相比，直接检测氧化产物更可靠，可以减少假阳性结果。反应如果产生有颜色的或者有荧光的产物，可以更容易检测到活性。例如，有一类 P450 对吲哚有氧化活性，可以产生一些色素，如靛蓝和靛玉红[20]。 2.3 一类新的精确检测的方法

高效液相色谱（HPLC ）以及质谱（MS ）为 P450 的活性检测提供了更通用而精确的方法。虽然与色谱法相比这些方法的通量较低，科学家也在努力提高质谱法的检测通量[21]。Tang 等[22]建立了一种利用 LC-MS 及同位素标记的方法确定 P450 底物的方法。他们筛选组织提取物作为 P450 的内源性底物：首先建立一个含有辅因子和组织提取物的 P450 反应体系，并在体系内以 1:1 的比例加入

18

O 2/16O 2，然后利用 LC-MS 检测反应体系中的有机提取

物，最后用生物信息学工具分析，同位素标记的产物以 M/M+2 双峰的形式出现。傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR/MS）具有极高的质谱分辨率和精确度，对复杂的混合物可以直接进样分析而不用先进行色谱分离，在底物分离试验中引起了广泛的兴趣[23]。Furuya 建立了一种利用 FT-ICR/MS 筛选单加氧酶底物的策略[24]，利用这种方法，他们发现了三个枯草杆菌 P450（CYP107J1、CYP109B1 和 CYP134A1）和三个蜡状芽孢杆菌 P450（CYP106、CYP107 和 CYP109）。

2.4 筛选与检测方法的应用

利用基因挖掘的方法可以找到更多新的 P450，高通量的质谱检测方法在对这些酶的底物进行大量筛选时会非常有用。寻找与筛选方法相结合，从基因库中挖掘得到了一

2 P450 催化活性的筛选方法

根据上面的介绍可以发现，虽然通过分析基因组序列信息可以寻找到一些新的 P450 酶，但是有时只通过基因组序列信息本身还不能确定酶的底物和功能，就需要高

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4-Ethylbenzoic acid 4-(1-hydroxyethl)- 4-Vinyl-benzoic acid Indole-2-cardoxylic 2-Indolinone-6-cardoxtlie benzoic acid acid

acid

2-Naphthoic acid 7-Hydroxy-2-naphthoic 8-Hydroxy-2-naphthoic acid

acid

1-Hydroxy-2- 1, 7-Dihydroxy-2- Quinoline-6-carboxylic 3-Hydroxquinoline-6- naphthoic acid naphthoic acid acid carboxylic

acid

3-Hydroxy-2- 3, 7-Dihydroxy-2- 6-Hydroxy-2- naphthoic 6, 7-Dihydroxy-2- naphthoic acid naphthoic acid acid naphthoic acid

图 2 CYP199A2 催化的反应

些全新的 P450，例如 CYP199A2 就可以催化一系列有趣的反应。CYP199A2 在较早被报道对对位取代的苯甲酸有氧化活性，它是一类高效的芳香酸氧化酶[25]。而 Furuya 和 Kino 在通过比色检测法筛选约 100 个细菌 P450 对 2-萘酸的羟化活性的时候发现，CYP199A2 是一个 2-萘酸单加氧酶。对反应产物进行鉴定发现，CYP199A2 可以把 2-萘酸氧化为 7 位或 8 位羟化的 2-萘酸，它也可以催化三种羟基 2-萘酸氧化为相应的二羟基-2-萘酸，选择性的氧化吲哚及喹啉酸反应。

[26]

生化特征。基因挖掘的方法与其他现有的及新的技术相结合，为生物催化氧化更广泛的应用提供了新的可能性。

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3 结论

利用基因组序列鉴定的 P450 基因形成了一个大的基因库，作为新的生物氧化剂的来源引起了广泛的关注。利用已知功能的 P450，如 CYP102A1 和 CYP152A1 的同源基因，可以挖掘出具有新的底物特异性和产物选择性的酶。另外，一些 P450 家族的酶催化机制目前仍然是未知的。将来通过基因序列分析可以更快地获得推定的 P450，但是单靠基因序列信息不能确定酶的底物，就需要利用一些高通量的分析方法，如质谱法对这些酶的底物进行大规模的筛选。基因序列信息还可用于鉴定 P450 的氧化还原配体，这些配体又在对P450 的催化活性进行优化的过程中有重要影响。除了在体外筛选和鉴定酶的底物，鉴定和分析新发现的 P450 的晶体结构不仅可以得到大量具有形形色色底物专一性的生物氧化酶，也可以获得 P450 新的

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