抗生素研究进展

文献综述

抗生素发酵研究进展

专业年级 13生物工程 学院 环资学院 学生姓名 指导教师

抗生素发酵研究进展

王先府

（重庆工商大学环资学院2013级生物班2013125142）

摘 要：抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质，由于其在自然条件下不易获得，现可利用发酵来生产抗生素，本文对抗生素发酵研究过程多方面进行综述。

关键词：抗生素；菌渣；过程优化

Advances in antibiotic fermentation

Jeff

（College of environment and resources, Industrial and Commercial University Of Chongqing,2013125142）

Abstract ：Antibiotics are by microorganisms,(including bacteria, fungi, actinomycetes spp.) or higher plants and animals produced in the process of life with resistance to pathogens or other activity of a class of secondary metabolites, can interfere with other living cells development function of chemical substances, due to its under natural conditions is not easy to get, is now available by fermentation to produce antibiotic, against the students ferment process research are reviewed.

Key words：antibiotics; mushroom residue; process optimization

采用发酵工程技术生产医药产品是制药工程的重要部分, 其中抗生素是我国医药生产的大宗产品, 随着基因工程技术的进展, 基因工程药的比例逐渐增大, 但抗生素在国计民生中所起的作用是不能完全替代的, 特别是西方国家出于能源和环保的考虑, 转产生产高附加值的药物, 留出了抗生素的市场空间, 为我国的抗生素生产发展提供了机遇, 作为一个发展中的国家, 可以说在相当长时间内, 我国抗生素生产在整个医药产品中仍占很大的比例。

1 全发酵研发情况

中国最早生产的全发酵抗生素品种为饲用土霉素钙。世纪年代内蒙古金河生物科技公司等4家 抗生素发酵企业开始生产全发酵金霉素产品，并以内蒙古金河生物科技公司的国内国际的市场占有量最大。目前国内有25家抗生素发酵生产企业生产全发酵抗生素产品，产品主要有黄霉素预混剂、饲用金霉素、那西肽预混剂、硫酸黏菌素预混剂、恩拉霉素预混剂、杆菌肽锌预混剂、亚甲基双水杨酸杆菌肽预混剂等由于含量规格不同，目前在我国共获得70多个产品批准文号。这些产品对我国 的动物养殖发挥了重要作用主要体现在：①治疗某些动物疾病；②预防某些动物疾病尤其是对那些 传染性疾病的预防，保证畜禽的健康生长；③促生长作用使畜禽生长速度加快，可使某些饲养动物缩短喂养周期；④提高饲料转化率也即饲料利用率，使之利用较少的饲料达到相同饲喂效果从而节 省饲料提高生产效益⑤提高动物产品质量这其中主要是可提高肉蛋奶的产品质量⑥提高动物机能 的抵抗力从而增强动物应付外界不良环境的能力。

近多年来，我国养殖业迅猛发展养殖模式从散养逐步转变集约化养殖，同时我国全发酵抗生素 企业的生产技术和研发水平也逐步与国际接轨。 因此，我国企业生产的全发酵抗生素产品在国内和国际占有相当的市场。例 如，浙江海正药业股份有限公司生产的恩拉霉素预混剂一个品种一年的销

售额过亿元人民币。在满足国内市场需求的同时，这些企业积极开拓国际市场。由于我国能源、人工和原材料成本低，我国生产的全发酵产品迅速占领国际市场其中金河生物集团早在1994年就通过美国对金霉素产品的注册审批，并先后通过了5次组织的现场检査。其生产的饲用金霉素产品主要出 口到美国。金河生物集团、濮阳泓天威药业有限公司、浙江升华拜克股份有限公司均已通过澳大利 亚APVMA 验收可以向澳大利亚、新西兰等国家地区供货。其他几家企业生产的饲用金霉素、盐霉素预混剂、莫能菌素预混剂、恩拉霉素预混剂、杆菌肽锌预混剂等产品大量出口北美、亚太以及南美国家。此类全发酵产品在国际市场上有着稳定的市场份额。

2 国内外部分抗生素固态发酵研究概况

2.1 头孢菌素C 的固态发酵

早在1984年, 中国台湾的Wang H H等[1]就研究了利用大米来生产头孢菌素C 。他们对发酵条件进行了较为细致的研究, 得到的条件如下: 以大米作为主要基质, 其中含有0. 65 % (质量分数) 的蛋白胨, 0. 65%的硫酸铵, 0. 26%的肌醇, 1 .3%(体积质量比) 的微量元素溶液, 0. 65%的碳酸钙, 0 .65 %的 硫酸钙, 0 .065%的硫酸钾, 1 .3 %的蔗糖 , 0 .13 %的DL- 蛋氨酸和2 .6 %的甲基油酸盐。初始含水量为49%～ 51 %,水活度是0 .985,发酵温度25 ℃, 发酵时间7 d, 产量达到6. 42 mg /g。

Jermini M F和Demain A L [2]研究了Strepto-mycesclavuligerus 和Cephalosporium acremonium固态发酵产头孢菌素的条件。S. clavuligerus NR-RL 3585用大麦发酵7 d 产量达到300 mg /g 基质, C. acremonium 发酵10 d产量达到950 mg /g。K. Adinarayana等[3]对用Acremonium chry-sogenum ATCC 48272 固态发酵生产头孢菌素C 的条件进行了优化。他们对不同的基质原料进行了选择, 在麸皮、Wheat rawa 、Bombay rawa、大麦和米糠中,Wheat rawa 最适合头孢菌素的生产。以 Wheat rawa为主要基质, 对其他条件进行优化如下: Wheat rawa 加入1% ( 质量分数) 的可溶性淀粉,1% (质量分数) 的酵母提取物, 培养温度30℃, 营养盐按1 .5∶10(体积质量比) 的比例加入, 接种量10% (体积质量比), 初始含水量为80%, 初始 pH 值6 .5。在此条件下, 头孢菌素C 的产量达到22 .281 mg /g。

2.2 头霉素C 的固态发酵

头霉素C 是一种广谱的β-内酰氨类的抗生素, 可由多种微生物产生, 如 Nocardia lactamdurans, Streptomyces catteya和S. clauverigerus。因液态深层发酵需要消耗较多的能量, 人们开始研究利用 固态发酵的方法来生产头霉素C 。Krishna Prasad Kota和Padma Sridhar[4-5]对利用麸皮固态发酵生产头霉素C 进行了研究。固态发酵条件为 : 麸皮5 g ,棉籽脱脂饼粉5 g ,葵花籽饼粉5 g ,玉米浆1 g ,基质初始含水量为 80 %,初始 pH 值为6. 5, 发酵温度在28～30℃, 发酵周期约5 d 。Streptomyces clavuligerus 的生长在第2天看到, 从第3天开始生成大量菌丝, 到第5天时菌丝量达到稳定。头霉素C 在第3天开始生成, 在第5天的时候则以15 mg /g基质的最大速率生成, 直到第 30天都基本保持稳定。研究表明, 固态发酵所生产的头霉素C 比液态发酵方法所产具有更好的稳定性, Balkrishnan 和 Pandey [2]的研究结果与此类似。固态发酵中头霉素C 产生的最佳温度和pH 都与液态发酵中是一致的, 但是在固态发酵中很难维持恒定的温度和 pH 值。

2.3 青霉素的固态发酵

青霉素的固态发酵由于其产量较高曾经在一段时间受到广泛关注, 后来随着液态深层发酵水平的提高逐渐被忽视。Barrios- Gonzalez 等[6]证实了怎样在短时间内用固态发酵方法大量地生产青霉素。在液态发酵条件下, 报道的最大产量为9. 8mg /L ,而在固态发酵条件下, 产量为13 mg /g ,这证实了固态发酵的经济性和可行性。

J. Barrios- González 等[7]研究了用营养液浸泡甘蔗渣在非无菌条件下固态发酵产青霉素的情况。结果显示, 这种方法可大大提高青霉素的产量, 提高初始含水量到70%有利于青霉素的产生(以后的研究[8]发现甘蔗渣、 营养物质、水三者的比例不同对青霉素的产量影响较大), 与液态发酵的比较显示出一定的优越性。在甘蔗渣作支持物固态发酵生产青霉素的研究中, 用较大颗粒(14 mm)的甘蔗渣可使青霉素的产量提高37%,但这一影响是归因于蔗渣中较高的糖含量。提高填充密度青霉素的产量可提高20 %,如果通气带走的水分能及时补充, 通气不会对青霉素的产量产生较大的影响[9]。 3 抗生素菌渣资源化再利用

3.1 重新用于发酵替代培养基氮源

抗生素菌渣因其含有的丰富的蛋白质，含氮量高，可以作为培养基中的氮源。抗生素菌渣用作培养基成分主要有两种方式：一种是直接将菌渣研磨过筛后用于替代发酵培养基中的氮源；一种则是利用酵母菌和芽孢杆菌等对菌渣进行固体发酵，达到生物改性的目的后，再用在培养基中或者制成如酵母膏之类的高值化培养基成分。

抗生素菌渣直接用于发酵培养基早在1961年，Ghosh 等[10]通过研究发现青霉素废菌渣在不经过任何预处理的情况下，就能用作青霉素发酵培养基中的唯一氮源，并取得了很好的效果。在不减发酵产青霉素效价的前提下，菌丝体重复利用的次数可达5次。近年来国内也有相关的研究，蔡翔等[11]研究利用可利霉素菌渣替代发酵培养基中的有机氮源，菌渣作唯一氮源时，加量为4%，效价最高，达到对照的77%，然后通过正交试验优化发酵条件，最终可利霉素效价达到对照的88%。虽然抗生素产量稍有下降，但是生产成本降低，处理方便，同时解决了菌渣处理的难题，保护环境。然而抗生素菌渣含有抗生素残留及有毒代谢产物，散发异味等不利因素，不但使得适用该处理方式的抗生素菌渣种类较少，而且目前这方面的相关文献报道中，某一抗生素菌渣也仅用于该抗生素发酵，适用性较窄。为此大部分菌渣通常需要进行无害化预处理以及生物改性，使其能更好地应用于发酵培养基。

3.2 能源化利用

抗生素菌渣含有丰富的生物质，故可以同其他生物质资源一样利用厌氧发酵，热解或者水热的方式进行能源化利用。

厌氧发酵是将含有高有机质的废弃物，如猪粪，有机垃圾、蔬菜废弃物和秸秆等资源化利用，变废为沼气的很好的处理方式，抗生素菌渣含有丰富的有机质，因而可采用厌氧发酵的方式达到减量化和资源化的目的，且这种处理方式既减少环境污染，又获得了经济效益。厌氧发酵处理适用性较广，可用于多种类型的抗生素菌渣，如红霉素、林可霉素、青霉素、四环素、洁霉素和麦迪霉素等[12-16]。

但是由于抗生素菌渣 C/ N 比较低，蛋白质含量高，故其水解会造成氨氮的积累，氨氮和残留抗生素是其厌氧发酵的两个重要的抑制因素[14]。过多的氨氮可以通过添加碳源来处理[13]，抗生素残留则可通过降解菌或者降解酶预处理，而且一定浓度抗生素残留对产甲烷菌存在抑制作用的同时也能对其驯化。刘子旭等[17]发现甲烷菌的活性会受到红霉素的抑制，未投加红霉素时甲烷的含量为68% ，在150 m g/ L 的红霉素浓度下，甲烷菌的甲烷产量降低约 0% ，250 m g/ L 时甲烷菌基本丧失活性。通过保持添加20 m g/ L 的红霉素浓度不变，连续运行60 d，初始时甲烷含量下降到49. 5% ，运行20 d、40 d和60 d 后甲烷含量呈现递增趋势，分别增长至52. 6% 56%和64. 2%。虽未达到未投加红霉素的时候的68%的甲烷含量，但仅下降4% 。说明通过甲烷菌对抗生素的驯化能力，利用驯化的甲烷菌也能在一定程度上提高厌氧发酵效果。

除此之外，抗生素菌渣用于厌氧发酵还存在一个问题，菌丝体细胞壁存在由肽链交联的多糖成分，不利于生物降解[13]，因此对菌渣进行破壁处理有益于厌氧发酵。目前对菌渣的预处理常见的有物理方法： 微波法和超声破碎法； 化学方法： 酸热法和碱热法。选择高效且经济的破壁方式，具有很好的应用前景。韩庆等[18]通过对比微波法、碱热法和酸热法对青霉素菌丝体细胞壁的破壁效果发现，在相同的时间和温度条件下，碱热法的效果最好，且破壁所需的时间相对较短，具有最高的性价比。原因在于细胞壁主要由甲壳素、葡萄糖及聚糖醛酸等物质组成，这些物质大多在碱性条件不稳定，所以在碱性环境中破壁效果最好[19]。Zhong 等[13]通过对链霉素菌渣进行碱热预处理发现，反应器的生产性能和甲烷产量提高22. 08% -27. 08% ，菌渣去除率达到64. 09% ，总挥发性脂肪酸和氨氮的积累量都有所下降。因此，通过对菌渣进行合适的预处理，对其进行厌氧发酵实现菌渣减量化和能源化利用具有广阔的前景，同时厌氧发酵后的废渣，经过安全性分析后可用于农肥，实现综合利用。

热解液化处理是在缺氧和高温条件下处理有机物，将其由大分子分解成为小分子，甚至是气体， 主要获得生物油资源和部分燃气及焦炭[20]。水热法则是以高温的液态水作为反应介质，将生物质转化成燃气、生物油和焦炭等。水热法和热解法都能很好地对菌渣进行无害化处理，不同的是水热法的能效更高，所得油品的热值也更高，更易于制成液体燃料。张光义等[21]研究利用水热法处理头孢菌素 C 制备固态燃料过程中的特性，表明水热处理能对菌渣进行无害化处理，并实现多重效益。但由于水热处理存在条件要求苛刻，设备成本高，反应时间长等问题，应用受到很大的限制，目前水热技术还未得到推广应用。

4 过程优化控制理论的应用及其发展

抗生素发酵过程优化的另一重要内容就是各种控制理论的应用。早在上世纪中叶, 人们为了研究微生物过程特性, 开展以微生物细胞生长、 代谢及有关产物形成等动力学研究, 先后建立了Monod 、 Contois 等数学模型 , 随着以生产为目的的发酵过程优化技术的研究深入 , 特别是对细胞大规模培养技术的深入研究和对以分批培养为主要对象的发酵过程参数的时变性、多样性、耦合性和不确定性的认识, 在过程动力学数学模型为基础上 , 引进了一系列现代控制理论[22-24], 其中有静态和动态优化、系统识别 、 自适应控制、 专家系统、模糊控制、神经元网络等 。这种适应发酵过程非线性特征的研究方法为细胞大规模培养技术研究的深入开展以及提高学术研究水平起了很大的推进作用 , 但在实际工厂生产上仍有很大局限性。造成这种局限性的原因除发酵过程的高度非线性的

多容量特性 , 很难用一组线性或拟线性数学模型来精确描述外 , 如何实现从宏观描述到微观研究也是一个重要原因。本文提出的在发酵过程研究中应该重视细胞代谢流的问题实质上就属这种性质的问题。从控制论来看, 当前一个热点课题之一就是混沌现象的研究[25]。在我们进行抗生素发酵研究时 , 常发现发酵初期表现出过程的多态性和不稳定性 , 输入的初始条件的极细微的差别会产生结果的巨大变化, 这就是所谓发酵过程的混沌现象 。混沌是非线性系统所特有的一种运动形态, 它是确定性系统里由于内部随机性而产生的貌似无序的复杂运动 。但上述关于混沌现象的研究只是停留在对微生物过程混沌现象的揭示与表征, 对导致生物系统出现混沌现象的微观机理未做任何涉及。任何生物现象问题必需要从细胞生物学角度找原因, 这是近年来生物技术发展的共识 , 因此我们认为, 如何从微观认识来解释上述现象对抗生素发酵过程优化与放大研究将具重要意义。这也是当前化学工程与生物技术深度结合形成生物化工的新特点:由宏观迈向微观 , 强调在生物技术深入发展的基础上, 以微尺度的工程学观点研究过程特性。例如有人研究认为在发酵初期菌体处于对数生长阶段时 , 在数学模型研究时随着引入阶数的增加, 菌体浓度随着滞后时间的增大已经有了明显的振荡, 不再表现为单纯指数型生长, 若此时发酵过程出现底物限制或产物抑制, 以及代谢途经或调控操作等的改变, 发酵过程将会发生周期、 倍周期分岔直至混沌, 就显示出过程的多态性和

不稳定性 。

我们在红霉素与金霉素等抗生素发酵研究时, 发现早期 CER 、 pH 、 DO 、 OUR 、RQ 有一个相对应的上升峰或下降峰 , 反映了发酵初期的系统特征, 并进一步通过在线计算机数据采集的RQ 值变化, 发现在一定时期有机氮源同时被作为碳源使用, 即以碳氮骨架通过氨基酸进入到菌体, 如这时控制不恰当, 就会发生抗生素生产能力的大起大落, 即所谓混沌现象 。经初步研究和有关文献报道 , 发现可能是原核细胞中的一种普遍的代谢调控机制: 严谨响应( stringent response) [26,27]。即当生长环境中的氨基酸成为限制条件时, 空载 tRNA 水平升高, 当空载 tRNA 进入核糖体后, 启动严谨响应因子 , 同时伴随着菌丝分化现象及次级代谢产物合成的启动。这种状态反映了基因表型和细胞代谢特征的变化 , 控制混沌可以得到我们所需要的细胞生理状态, 有可能对提高抗生素发酵效价具有重要意义 。

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