蛋白质呈色反应实验原理

双缩脲反应

(一)、实验原理

尿素加热至180℃左右,生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键,其结构与双缩脲相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS —NH2,—CH2—NH2,—CRH —NH2,—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH 或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺(O =C ——C =O )等物质也有此反应。NH3也干扰此反应,因为NH-3与Cu-2+可生成暗蓝色的络离子Cu (NH3)42+。因此,一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

茚三酮反应

(一)、实验原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应,但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。

该反应十分灵敏,1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。

此反应的适宜pH 为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。

黄色反应

(一)、实验原理

含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

考马斯亮蓝反应

(一)、实验原理

考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。

它染色灵敏度高,比氨基黑高3倍。反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内,蛋白质浓度A595nm 值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。

一) 双缩脱反应:

1. 原理:

尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键,其结构与双缩脲相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

二) 二) 茚三酮反应

1. 原理:

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏,1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。

反应机理如下:此反应的适宜pH 为5—7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。


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