HPLC测定番石榴叶乙酸乙酯提取物中5种黄酮苷的含量

中华中医药杂志(原中国医药学报) 2014年8月第29卷第8期 CJTCMP , August 2014,Vol . 29, No. 8 2469

・论著・

HPLC测定番石榴叶乙酸乙酯提取物中5种

黄酮苷的含量

朱寅荻，刘洋洋，李春娜，范冰舵，魏茜，徐暾海，刘铜华

（北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室，北京 100029）

摘要：目的：建立番石榴叶提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的多成分的含量测定方法。方法：色谱柱：Sy n c r o n i s C 18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm，柱温40℃。结果：金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的线性范围为0.0318-0.2544μg（r =0.9998）、0.0575-0.4600μg（r =0.9998）、0.1860-1.4880μg（r =0.9998）、0.1482-1.1856μg（r =0.9998）、0.2012-1.6816μg（r =0.9998），平均加样回收率分别为100.7 （RSD =2.6%），100.5（RSD =0.8%），103.4（RSD =2.6%），98.1（RSD =1.7%），100.7（RSD =1.2%），精密度、重复性、稳定性均良好。结论：所建立的方法准确可靠，重复性好，可用于番石榴叶提取物的含量测定。

关键词：番石榴叶；乙酸乙酯；提取物；黄酮苷；含量测定；HPLC

基金资助：国际科技合作项目（No.2010DFB33260），北京中医药大学创新团队项目（No.2011-CXTD-19）

Determination the 5 fl avonoid glycosides of ethyl acetate extract from Psidium guajava

leaves with HPLC

ZHU Yin-di, LIU Yang-yang, LI Chun-na, FAN Bing-duo, WEI Qian, XU Tun-hai, LIU Tong-hua

( Health-cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China )

Abstract: Objective: To establish the quantitative analysis method for hyperin, isoquercitrin, reynoutrin, quercetin-3-O-β-D-arabinopyranoside, quercetin-3-O-α-L-furanarabino side ethyl acetate from Psidium guajava leaves extracts. Methods: High performance liquid chromatography (HPLC) was performed on a Syncronis C18 column (4.6mm×250mm, 5μm). The acetonitrile with 0.2% phosphoric acid (v/v) was used as an aqueous solvent (A) and CH3CN as an organic solvent (B) with gradient at a fl ow rate of 1.0mL/min. The column temperature was set at 40℃, and UV detection wavelength was at 254nm. Results: The quantitative analysis by HPLC showed that the linear rang of hyperin, isoquercitrin, reynoutrin, quercetin-3-O-β-D-arabinopyranoside, quercetin-3-O-α-L-furanarabino side ethyl acetate was 0.0318-0.2544μg (r =0.9998), 0.0575-0.4600μg (r =0.9998), 0.1860-1.4880μg (r =0.9998), 0.1482-1.1856μg(r =0.9998), 0.2012-1.6816μg (r =0.9998), respectively. The average recovery of sample above was, in order, 100.7 (RSD =2.6%), 100.5 (RSD =0.8%), 103.4 (RSD =2.6%),98.1 (RSD =1.7%), 100.7 (RSD =1.2%). Conclusion: The method was accurate, feasible and reliable, which was available for the quantitative analysis of ethyl acetate extract from Psidium guajava leaves.

Key words: Psidium guajava leaves; Ethyl: Acetate extract; Flavonoid glycosides; Determination; High performance

liquid chromatography

Fund assistance: International Science & Technology Cooperation Program of China (No.2010DFB33260),

Innovation Team Program of Beijing University of Chinese Medicine (No.2011-CXTD -19)

番石榴叶为桃金娘科番石榴属植物番石榴Psidium guajava L. 的干燥叶，产于华南各地至四川西南部，首以鸡矢茶载于《广西中药志》，味苦、涩，性平。具有收敛止泻、消炎止血功效[1]。中外民间医

药多有采用番石榴叶治疗糖尿病和腹泻等疾病，现代药理研究发现番石榴叶还具有降血糖、抗胰岛素抵抗等多方面的功能[2]。番石榴叶乙酸乙酯提取物能够降低对乙酰氨基酚诱导肝毒性升高的血清谷草转

通讯作者：徐暾海，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学逸夫科研楼412，邮编：100029，电话：010-64286935E -mail：[email protected]

2470 中华中医药杂志(原中国医药学报) 2014年8月第29卷第8期 CJTCMP , August 2014,Vol . 29, No. 8

表1 梯度洗脱程序

时间（min ）

035405055

[8]

[9]

254mm，4mm（1.00）[**************]0

-25

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min

氨酶，瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷具有很强的抗氧化活性[3-4]，异槲皮苷具有抗过敏、抑制α-葡萄糖酶作用[5]，金丝桃苷具有镇痛，抗氧化，保护心肌、肝脏作用以及抗乙肝病毒作用，具有广泛药理活性和潜在而良好的应用前景[6]。

在番石榴叶质量评价方面，相关文献报道有显微、薄层色谱鉴别；番石榴叶中槲皮素、番石榴苷

[7]

乙腈（%）

1414181825

0.2%磷酸水溶液

8686828275

的HPLC法含量测定；为进一步完善番石榴叶质量评价方法，本研究在参考黄酮类成分含量测定[10]的基础上，建立同时测定番石榴叶乙酸乙酯提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的多成分的含量测定方法，对有效控制番石榴叶的质量提供科学依据。

材料

1. 仪器 LC -15C高效液相色谱仪，配置DAD检测器，LCsolution色谱工作站（日本岛津公司）；MilliQ 超纯水仪（美国Millipore公司）。ML54电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；R200D型电子分析天平（德国Sartorius公司），Milli -Q超纯水机（美国Millipore）；KQ -400KDB高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2. 试药 金丝桃苷，异槲皮苷，瑞诺苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷均为本实验室自制，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷纯度均大于98.0%（HPLC ），瑞诺苷纯度为95.4%。乙腈为色谱纯（Fisher ），甲醇为分析纯（北京化工厂），水为超纯水。

番石榴叶购于北京双桥燕京中药饮片有限公司，批号：1103012，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为为桃金娘科番石榴属植物番石榴Psidium guajava L.的干燥叶，将其放在阴凉处风干，粉碎，用乙酸乙酯提取。方法与结果

1. 色谱条件 Syncronis C 18色谱柱（4.6mm×250m m，5μm），柱温40℃；流动相A为0.2%磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。检测波长254nm，流速1.0mL/min，进样量20μL。按照上述色谱条件进行测定，5种黄酮与其他共存峰均得到较好的分离，对照品及样品的色谱图见图1-图2。

图1 混合对照品的HPLC图

注：1.金丝桃苷；2.异槲皮苷；3.瑞诺苷；4.槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷；5.槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。下图同。

[1**********]00

254mm，4mm（1.00）

-10

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min

图2 番石榴叶乙酸乙酯提取物的HPLC图

2. 样品的制备

2.1 对照品溶液 分别精密称取金丝桃苷3.18mg，异槲皮苷5.75mg，瑞诺苷4.65mg，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷7.41mg，槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷10.51mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别精密量取1.0mL金丝桃苷，1.0mL异槲皮苷，4.0mL瑞诺苷，2.0mL槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，2.0mL槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷对照品溶液，置10mL量瓶中，得到混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液 取番石榴叶2.5g，加8倍量乙酸乙酯超声提取3次，得提取物1和2；取番石榴叶2.5g，加8倍量乙酸乙酯超声提取至乙酸乙酯提取液接近无色，得提取物3。取番石榴叶乙酸乙酯提取物1和2，精密称定60mg，置10mL量瓶中，加入甲醇5mL，超声处理3min，冷却至室温后，用甲醇定容至刻度，过0.45μm 微孔滤膜；取番石榴叶乙酸乙酯提取物3，精密称定60mg，置50mL量瓶中，加入甲醇25mL，超声处理3min，冷却至室温

中华中医药杂志(原中国医药学报) 2014年8月第29卷第8期 CJTCMP , August 2014,Vol . 29, No. 8

表2 5个黄酮苷成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围（n =6）

化合物金丝桃苷异槲皮苷瑞诺苷

槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷

回归方程y =95 575x -17 895y =60 932x -2 233.3y =24 306x +11 856y =58 292x +22 777y =63 001x +38 139

R 20.99980.99980.99980.99980.9998

线性范围（μg）0.0318-0.25440.0575-0.46000.1860-1.48800.1482-1.18560.2012-1.6816

2471

-±s ，n =3）表3 番石榴叶提取物中5种黄酮苷的含量（x

样品1 23

金丝桃苷0.873±0.0100.508±0.0285.668±0.011

异槲皮苷1.534±0.0141.094±0.0255.691±0.020

瑞诺苷5.118±0.0113.582±0.02016.180±0.014

槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷

4.161±0.0092.359±0.02614.026±0.014

槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷

5.734±0.0114.244±0.01413.027±0.016

后，用甲醇定容至刻度，过0.45μm 微孔滤膜，得番石榴叶提取物的供试品溶液。

3. 线性关系的考察 将混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释成2、3、4、6、8倍系列浓度的混合对照品溶液，分别进样20μL，以峰面积为纵坐标，以对照品质量浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，见表2。

4. 精密度考察 精密吸取稀释4倍混合对照品溶液，连续进样6次，测定金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷色谱峰峰面积，计算RSD （n =6）分别为0.8%、1.4%、1.2%、1.3%、1.3%。

5. 重复性试验 番石榴叶乙酸乙酯提取物1，精密称定6份，按“2.2”项下方法制得供试品溶液，在上述色谱条件下进样，测定金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的平均含量（n =6）分RSD 分别别为0.879、1.545、5.167、4.017、5.768mg/g；为1.5%、2.8%、2.3%、2.1%、2.0%，表明该方法重复性良好。

6. 稳定性考察 取“2.2”项下方法供试品溶液，在室温下放置，分别于制备后0、2、4、8、12、24h进样，测定金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的色谱峰峰面积，计算RSD （n =6）分别为1.3%、1.5%、0.8%、0.8%、0.7%；表明供试品溶液在24h内基本稳定。

7. 回收率试验 取已知金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷含量的番石榴叶乙

酸乙酯提取物1共6份，每份约30mg，精密称定，置10mL容量瓶，分别精密加入对照品适量，按“2.2.”项下方法制得供试溶液，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，计算加样回收率，金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的平均加样回收率分别为100.7（RSD =2.6%），100.5（RSD =0.8%），103.4（RSD =2.6%），98.1（RSD =1.7%），100.7（RSD =1.2%）。

8. 样品测定 取番石榴叶乙酸乙酯提取物1、2及3各60mg，精密称定。按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，精密吸取供试品溶液20μL，在记录色谱图，并以外标法计算样品中5个指标成分的含量，番石榴叶乙酸乙酯提取物1、2和3样品中均为瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷的含量较高，金丝桃苷和异槲皮苷的含量较低，结果见表3。

讨论

1. 检测波长的选择 取金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷对照品溶液，在200-400nm波长下扫描，结果金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷254nm处有较大紫外吸收。

2. 流动相的选择 由于所测定的成分均为槲皮素单糖苷类化合物，含有多酚羟基，显弱酸性，本研究考察了甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%甲酸水等多种流动相系统；金丝桃苷，异槲皮苷结构相似，采用甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.2%甲酸水各种洗脱程序均无法得到

2472 中华中医药杂志(原中国医药学报) 2014年8月第29卷第8期 CJTCMP , August 2014,Vol . 29, No. 8

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参 考 文 献

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个成分的含量.中华中医药杂志,2012,27(7):1795-1797

（收稿日期：2013年6月22日）

有效的分离；乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%甲酸水均可对5个成分较好的分离，乙腈-0.2%磷酸水所得峰形较好，故选用乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脱作为流动相。

3. 含量的比较 番石榴叶提取物1和2均为8倍量乙酸乙酯超声提取3次，5个槲皮素单糖苷的含量较低；提取物3为8倍量乙酸乙酯超声提取至乙酸乙酯提取液接近无色，5个槲皮素单糖苷的含量较高；其原因可能为乙酸乙酯细胞渗透力较低需多次提取才能完全。

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・论著・

银莱汤对食积肺炎小鼠肠黏膜机械屏障的

作用及机制

刘铁钢，于河，张望，吕国凯，甄建华，李晓菲，董斐，谷晓红

（北京中医药大学，北京 100029）

摘要：目的：制作食积肺炎动物模型，探讨银莱汤对动物模型肠黏膜机械屏障的作用机制，证明肺与胃肠同治理论的有效性，为指导临床疾病的防治提供实验研究依据。方法：实验小鼠随机分为正常组、感染组、食积组、食积感染组、食积治疗组、食积感染治疗组。制作食积肺炎动物模型，给予银莱汤治疗，观察实验各组肠黏膜形态学变化、肠组织ZO-1及血清内毒素水平。 结果：食积组、食积感染组小鼠肠黏膜上皮细胞及杯状细胞增大增多，排列紊乱；食积治疗组、食积感染治疗组肠黏膜上皮细胞及杯状细胞排列整齐。食积组、食积感染组小鼠肠组织ZO-1水平较正常组显著下降（P ＜0.01）；食积治疗组显著高于食积组（P ＜0.01）；食积感染治疗组显著高于食积感染组（P ＜0.01）。各组小鼠血清内毒素水平与正常组比较均无显著性差异。结论：肺与胃肠积热会影响肠黏膜分泌功能，造成肠黏膜机械屏障损伤，其损伤机制与肠黏膜ZO-1的破环有关。银莱汤能够调节肠黏膜分泌功能，修复肠黏膜ZO-1，对肠黏膜机械屏障具有保护作用。

关键词：银莱汤；食积；肺炎；肠黏膜机械屏障；ZO-1

基金资助：北京中医药大学自主科研课题（No.2012-JYBZZ-JS040），国家自然科学基金项目（No.81273994）

通讯作者：谷晓红，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学，邮编：100029，电话：010-64286657E -mail：[email protected]