ELISA双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究

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防检技术

中国动物检疫２００８年第２５卷第１期

ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究

魏锁成

何

丽

（西北民族大学动物医学研究所

甘肃

兰州

７３００３０）

摘要：应用ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法对幼犬轮状病毒感染情况进行调查，结果表明兰州地区幼犬轮状病毒感染阳性率为５７．１％，其中２～４月龄的幼犬占阳性病例的７５．０％，而２月龄以内及大于４月龄的犬感染轮状病毒的病例较少。

关键词：轮状病毒；ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法；幼犬；兰州地区

犬轮状病毒病是由犬轮状病毒（Ｃａｎｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＣＲＶ）引起的犬的一种急性胃肠道传染病，多发于幼犬，发病率高，临床上以腹泻为特征。本病多发于秋冬季，尤其是晚冬至早春的寒冷季节。由于尚无有效的犬轮状病毒疫苗，且此类疾病因抗生素、磺胺类等抗生素对其无效，又因不同疾病引起的腹泻在临床表现特征、疾病流行方式上均十分相似，使此类疾病的临床鉴别诊断十分困难。本实验采用ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，对兰州地区采集的犬腹泻样品进行检测，以此来了解兰州地区犬类轮状病毒的感染情况，从而对本病的诊治提供依据。１材料与方法

１．１样品来源：兰州地区门诊腹泻犬粪样３５份，均为临床所见腹泻病犬，病程１ｄ～３ｄ，年龄１日～１２月之间，其中母犬１３只，公犬２２只。１．２检测试剂盒：为轮状病毒酶标诊断试剂盒（兰州生物制品研究所生产），内含４８孔包被反应板、酶结合物、阳性对照、阴性对照、酶标洗液、终止液等。

１．３粪样的稀释：对于过干粪样，用适量生理盐水（约１∶１０）稀释。

１．４洗液的配制：取２０ｍｌ酶标洗液（浓缩液），加入到１８０ｍｌ蒸馏水中，按１∶１０倍稀释。

１．５器皿的准备：检测过程中所应用到的量筒、烧杯等器皿，均经高压蒸汽灭菌器１５磅２０ｍｉｎ灭菌。

１．６实验程序：按轮状病毒酶标诊断试剂盒使用说明书进行。

１．７结果判定：使用酶标仪（美国热电ＴＨＥＲＭＯ，ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＫ），以空白孔调零，测定反应后各孔在４５０ｎｍ处的波长读数，即ＯＤ４５０值。

检品孔ＯＤ４５０值（Ｓ）／阴性对照

项目来源：国家民委２００２年度重点资助项目（ＭＷ２００２－ＺＤ－０１０），甘肃省２００７年度科技支撑课题（ＧＫ２００７－１４９－１０１）

ＯＤ４５０值（Ｎ）≥２．１者为阳性；＜２．１者为阴性；（若Ｎ＜０．０５，按０．０５计算）；

实验有效性：阳性对照ＯＤ４５０值（Ｐ）＞０．５，则实验成立。２结果

２．１标准对照抗原检测：本次实验共做标准阳性对照和标准阴性对照各２份次，空白对照１份次，反应后测定ＯＤ４５０值，阳性对照ＯＤ４５０分别为２．３６５、２．５２９，平均值为２．４４７＞０．５，阴性对照ＯＤ４５０值分别为０．０４４、０．０４３，平均值为０．０４４；空白对照ＯＤ４５０值为０．０００，对照系统正常，试验成立。２．２样品抗原测定：共检测腹泻犬类粪样３５份，检测出样品阳性为２０份，阳性率约为５７．１％；对检出阳性样品进行重复实验，结果相同。具体数据结果如下表所示。３分析与讨论

３．１检测结果表明，幼犬的轮状病毒感染在兰州市部分地区已普遍存在，通过对本次采样病犬年龄和检测阳性结果进行统计可以发现，犬轮状病毒感染以２～４月龄幼犬检测的阳性率较高，约为４２．９％；而２月龄以内及４月龄以外的幼犬则阳性率较低，约为１４．３％。这可能是因为２月龄以内的幼犬体内存在母源抗体的保护而不易感染发病，而大于４月龄的犬则自身可能已对该病毒感染具有一定的抵抗力，因此感染率亦较低。２～４月龄的幼犬，由于体内母源抗体逐渐减少，而自身的抗轮状病毒抗体尚未产生或产生很少，不足以产生有效的保护力，再加上外界各种因素的影响（如温度、环境卫生状况、饮食等），使得此阶段幼犬的抵抗力下降，因而临床上的感染发病率高于其他阶段犬类。

３．２轮状病毒可感染各种幼龄动物，如犊牛、羊、兔、驹等而引起发病，且能交叉感染，只要该病毒在一种动物中存在，就可能造成本病在自然界中长期存并传播，这也是本病普遍存在的重要因素。由于轮状病毒对外界环

多境具有较强的抵抗力，对温度、ｐＨ、

种化学试剂、消毒剂等都有抵抗力，

中国动物检疫２００８年第２５卷第１期

疫病防治

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本栏目主持人：王伟涛

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雏鸡氟苯尼考中毒的康复疗法

李绍文

（云南省陇川县畜牧兽医局

６７８７００）

稀释，再加入乳酸菌素６０片（０．５ｇ／片碾成细粉），搅拌溶解后倒入饮水桶内，摆放鸡舍中，让鸡自由饮服，药水饮完后再给予清洁饮水。每天投药两次，连喂４天，在整个投药过程中，饲料采用全天给料，自由采食。４效果

经组方一治疗４天后，绝大多数病鸡精神状态基本恢复，开始少量采食采饮。经组方二治疗４天后，患鸡精神状态完全恢复，采食饮水已恢复到正常水平，至此鸡群治愈康复。５小结

氟苯尼考系甲砜霉素的单氟衍生物，为动物专用广谱抗生素，禽用剂量为５０－７０ｍｇ／ｋｇ体重，超过极量易发生中毒现象，畜主投药剂量达到３００ｍｇ／ｋｇ体重，超过极量３倍多，发生中毒在所难免。

雏鸡在饲养过程中由于体质弱小，抗病力差，容易染病死亡，特别是平地饲养，粪便清扫消毒不及时，更易染患大肠杆菌致发拉痢现象。

建议养鸡户饲养雏鸡时，最好采用高架网床饲养，以减少病菌感染。一旦鸡群染疫患病，治疗用药时不要妄听乱用，应到正规兽医诊疗部门请经验丰富的兽医到现场诊治，治疗药物最好选择疗效好、负作用小、毒性低的药物，避免发生不必要的损失。

月８日下午畜主携带病鸡２只到本

一养鸡户因雏鸡发生拉痢，畜主在养单位请求检查诊治。鸡同行的指导下，使用氟苯尼考（商２检查诊断

外观所见病鸡精神萎，不愿走品名痢立停）治疗，３天后拉痢现象消

失，但雏鸡开始出现精神萎顿，少食动，眼结膜苍白，泄殖腔口干净。解剖少饮，生长滞缓并发生零星死亡现变化：素囊空虚无食物，有大量酸臭象，后经笔者诊治，１０天后恢复健康，液体，素囊内粘膜充血，腺胃空虚，内

壁有充血现象，肌胃内无食物但有少现将诊治经过介绍如下：

量沙粒，肠壁充血，有少量肠粘膜脱１基本情况

２００７年７月１５日畜主李某从昆落，肝脏，肾脏颜色变淡，其它内脏器明购入广西出壳土杂鸡苗５１０只，脱无典型病理变化。根据临床症状和解温饲养至８月１日，除零星正常死亡剖变化结合畜主用药情况，初步诊断１０只外，鸡群基本正常。当日畜主自为氟苯尼考投喂过量所致药物中毒。购鸡新城疫Ⅱ系毒疫苗，对雏鸡进行３治疗

滴鼻免疫。８月３日约三分之一的雏３．１解毒健体，用葡萄糖粉和电解多鸡出现拉痢现象，次日病鸡数量有所维混合兑水饮服，喂药前停水３小增加，经养鸡同行介绍，畜主到兽药时，增加雏鸡渴饮欲提高饮药量和饮店自购兽药氟苯尼考（商品名、痢立药速度。剂量与方法：雏鸡４６３只，一停、山东利中动物药业有限公司出次用葡萄糖粉２５０ｇ，电解多维７０ｇ，品，生产日期０７年５月１０日，有效将两种药物混合后加凉开水１００００期至０９年４月）粉剂进行投喂治疗，ｍＬ，搅拌溶解后倒入自动饮水桶内，摆投药剂量；５００羽雏鸡（平均体重约放鸡舍中让雏鸡自由饮服，一般９０－２００ｇ），用氟苯尼考粉剂３０ｇ（６０ｍｇ／１００分钟饮完，尔后再给予清洁饮水，羽，等于３００ｍｇ／ｋｇ体重），兑入洁净每天投喂两次，连喂４天，然后停药２水２００００ｍＬ，搅拌后装入自动饮水天，第３天开始投喂另一组方药物。桶内投饮服用；每天１次，连喂３天。３．２重建消化道微生物系统，恢复雏３天后雏鸡拉痢基本停止，８月７日鸡消化功能，用群众自行酿制的食醋畜主发现部分雏鸡出现素囊空泡，精兑水稀释再加入乳酸菌素（人用药神萎顿，少食少饮，生长滞缓，并发生品），喂药前停水２小时。

剂量与方法：４６３只鸡一次用自酿零星死亡，次日死亡数量有所增加

（两天共死亡３７只），情急之下于８食醋１５００ｍＬ，加入凉开水７０００ｍＬ

２００７年８月我县章凤镇拉影村

且在成年动物多呈隐性感染并不断排毒，因此一旦畜禽群发生本病，就很可能每年连续发生。

３．３ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法操作简便，价格相对较低，灵敏度和特异性高，不存在放射污染，且可根据检测目的的不同设计包被抗体和检测抗体。但该法存在一定假阳性的可能性，因此在实际检测过程中应通过阻断实验或重复实验以予排除。本次检测中，对于初次检测呈阳性的样品进行了重复性检测，从而增强了检测结果的可靠性。

３．４造成犬类腹泻的疾病很多，如严重的犬瘟热、细小病毒感染、冠状病毒感染等，有些较易区别，但有些在

临床鉴别诊断过程中则存在一定困难。在本次采样及检测过程中发现，经检测呈阳性的样品大多数为淡黄或鲜黄色稀粪，因此在临床诊断过程中若发现此类腹泻的幼犬，应结合其它症状谨慎下结论。参考文献

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炎病原学三种检测方法对比与临床关系的分析．临床儿科杂志，２００１，１９

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［６］司徒镇强，吴正军．细胞培养．第一版．西安：世界图书出版社，２００４．３

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