胞内蛋白提取

细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。

超声破碎的条件一般是300w ，10s/10s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。

超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS 将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！

如何判断是否超声完全：一般有以下几个方面：

1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。 2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。

3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。 4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检。超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。

一些需要注意的问题：

1，蛋白以包涵体形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。

2，如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。

3，超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。

4，尽量防止泡沫的产生。

若是直接用于做SDS-PAGE 的话，可以取1ml 离心，弃上清，加50ul 的PBS 溶液，然后再加50ul 2xSDS-PAGE上样缓冲溶液，上样前99度加热5min 后，离心取上清即可

、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG 至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用

反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

要是只用来做SDS-PAGE 的话

直接收集菌体

SDS 煮沸破裂

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胞内蛋白提取

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