水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制作用

　　[摘要] 目的 探讨水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶的影响作用。 方法 将水芹总酚酸和阳性对照药奈韦拉平用磷酸盐缓冲液（PBS）和二甲基亚砜（DMSO）分别配制成10、1、0.1 mg/L和50（13.32 mg/L）、10（2.66 mg/L）、1 μmol/L（0.27 mg/L）的药液，加入Oligo（dT）15包被板中，最终用酶标仪测定405 nm波长处OD值，计算各加药组OD值/空白对照组OD值，判断药物对HIV逆转录酶的影响。 结果 与空白对照组相比，水芹总酚酸对HIV逆转录酶活性有较强的抑制作用，高、中、低剂量组的OD值分别为（0.316±0.033）、（0.442±0.044）、（0.627±0.009）；平均抑制率分别为85.20%、73.67%和55.83%，具有良好的量效关系（P 　　[关键词] 水芹总酚酸；HIV逆转录酶；酶联免疫 　　[中图分类号] R969.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0004-03 　　水芹是我国的传统中药，文献报道水芹具有良好的保肝降酶退黄作用[1]。研究表明，水芹总酚酸（total phenolics acid extracted from Oenanthe Javanica，OJTPA）是水芹的有效成分之一，体内外实验均表明其对乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的复制有较强的抑制作用。水芹总酚酸能够有效抑制HepG2 2.2.15细胞的HBV DNA、共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）以及乙肝病毒e抗原（HBeAg）水平[2]。此外，在以感染鸭乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）的北京雏鸭为模型的试验中，OJTPA同样能够有效抑制DHBV的复制[3]。由于某些具有抗HBV活性的药物，例如：拉米夫定（Lamivudine，LAM）、替诺福韦（Tenofovir，TDF），同时能够抑制人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的复制，因此本研究通过HIV逆转录酶抑制剂酶联免疫的测定方法探讨OJTPA对HIV逆转录酶活性的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物 　　OJTPA：解放军第三�二医院药学部制备（批号：110415）。奈韦拉平（NVP 上海迪赛诺制药有限公司，批号：DH027-4-0409016）。 　　1.2 试剂 　　二甲基亚砜（Sigma公司，批号：10040214），DTT（Ameresco公司，批号：2502C321），Poly A（Roche公司，批号：12167321），PNPP（Sigma公司），DUTP（上海生工合成），DTTP（Takara公司，批号：CB6901A），Oligo（dT）15（由大连宝生物工程有限公司合成），小牛血清白蛋白（BSA北京中美转导科技公司），HIV逆转录酶（Calbiochemn公司，批号：D00103344），Tris（北京Biodee公司），碱磷酶标记链亲和素（APS，中山金桥公司），MgCl2・6H2O、KCl、NaOH（均为北京化工厂产品）。 　　1.3 仪器 　　低温高速离心机（SIGMA 3-18K），电子分析天平（上海宇恒平科学仪器），96孔细胞培养板（丹麦NUNC公司），酶联仪（美国BIO-RAD），漩涡混匀器（海门其林贝尔仪器制造），恒温水浴锅（Grant公司）。 　　1.4 方法 　　1.4.1 Oligo（dT）15包被板的制备 　　将Oligo（dT）15溶于100 mmol/L的1-甲基-咪唑的盐酸缓冲液中（pH 7.4），加入96孔酶标板中，与水溶性碳化二亚胺混匀，于50℃水浴中反应4 h，反应结束后用洗液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗3遍，除去未结合的Oligo（dT）15，将包被后的96孔板置4℃保存。 　　1.4.2 药液的配制 　　水芹总酚酸用DMSO和PBS配成10、1、0.1 mg/L的药液，阳性对照药奈韦拉平（NVP）用DMSO和PBS配成50、10、1 μmol/L的药液。 　　1.4.3 HIV逆转录酶活性检测 　　1.4.3.1 将药液分别加入到用PBS洗过的96孔培养板中，每孔10 μL，每浓度3孔。反应体系如下：70 μL的RT Buffer，20 μL含逆转录酶的PBS溶液，使反应系统总体积为100 μL[其中含50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，3 mmol/L MgCl2，75 mmol/L KCl，5 mmol/L DTT，0.13 mg/mL BSA，10 μg/mL poly（A），0.75 μmol/L biotin-11-Dutp，1.5 μmol/L dTTP及适量酶]。 　　1.4.3.2 37℃水浴1 h，用洗液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5， 0.15 mol/L NaCl，0.05 mmol/L MgCl2，0.02% Tween20）清洗3次，除去未结合的游离底物，再每孔加入100 μL 1% BSA，室温封闭30 min，阻止生物素与链亲和素蛋白的非特异性结合，洗板，每孔加入50 μL的SA-ALP稀释液（100 ng/mL），37℃水浴1 h，洗板，每孔加入50 μL PNPP（1 mg/mL，pH 9.5），37℃水浴30 min；每孔加入0.5 mol/L的NaOH终止反应。 　　1.4.3.3 酶标仪测定405 nm波长处OD值，以确定HIV逆转录酶的活性，同时设置不加药物的空白对照组，计算实验孔OD值/空白对照孔OD值（P/N值）。实验按以上方法重复一次作为第二批实验。 　　1.5 数据处理 　　采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析。抑制率按以下公式计算： 　　抑制率=×100% 　　2 结果 　　实验结果表明，OJTPA对HIV逆转录酶有显著的抑制作用。抑制率随着药物浓度的增大而升高，OJTPA高、中、低剂量组对HIV逆转录酶的平均抑制率分别为85.20%、73.67%、55.83%，与空白对照组比较差异有高度统计学意义（P 　　3 讨论 　　自1981年美国发现首例艾滋病以来，研究人员对艾滋病毒以及抗艾滋病毒治疗方法进行了广泛深入的研究。明确了HIV复制周期包括病毒的吸附与穿透、逆转录与整合、蛋白的翻译加工等关键阶段[4]。针对病毒复制的环节，不同作用靶点的抗HIV药物也相继而生。目前，临床应用的抗HIV药物主要包括以下几种类型：①病毒进入抑制剂（恩夫韦肽、麦瑞韦若克）；②核苷类逆转录酶抑制剂（地丹诺辛、司他夫定）；③非核苷类逆转录酶抑制剂（奈韦拉平、地拉韦定）；④蛋白酶抑制剂（沙奎那韦、安普那韦）；⑤整合酶抑制剂（雷特格韦）[5-7]。虽然这些药物的作用机制不尽相同，但临床应用的结果表明以上这些药物均能够抑制病毒的复制，降低病毒载量从而使得艾滋病的流行得到控制，感染者的生命延长[4]。但是，随之而来的不良反应及耐药问题也十分棘手。例如，目前临床应用的8种核苷逆转录酶抑制剂无一例外地诱发了耐药株的产生，并且有交叉耐药现象；HIV蛋白酶抑制剂的使用还会导致患者的肝功能异常、发热等不良反应[8]。因此，研发有效且毒副作用小的抗HIV药物仍然是药学工作者的重要任务。 　　众所周知，中药是一个丰富的资源宝库，近年来，国内越来越多的抗艾滋病毒药物的研究者也将目光投向了中草药。研究表明，野菊花、知母、黄柏、射干等中药具有抗HIV蛋白酶等作用[9-10]。此外，黄芪、薏苡仁等药物能够通过增强机体免疫达到治疗艾滋病的作用[11-12]。 　　水芹是一种常见中药，《神农本草经》和《本草纲目》均记载水芹的保肝退黄等作用。现代研究发现，水芹的抗乙肝病毒活性也比较显著，体内外实验结果表明其有效成分OJTPA能够抑制HBV DNA或DHBV DNA的复制[13-14]。此外，小鼠抗疲劳实验结果表明OJTPA能够通过增加能源储备、提高SOD活力等方式达到抗疲劳的作用[15]。但OJTPA对HIV逆转录酶的作用还鲜有报道，本研究旨在探讨其对HIV逆转录酶活性的影响作用。 　　不同于黄芪、甘草等中药是通过增强免疫来达到治疗艾滋病的效果，本研究通过酶联免疫的方法证明了OJTPA是一种作用较强的HIV逆转录酶抑制剂[16]。10 μg/mL OJTPA对HIV逆转录酶的平均抑制率为85.20%。以往用于筛选HIV逆转录酶抑制剂多采用3H掺入法，但由于这种方法需要使用同位素，因此限制了其广泛应用。在本实验中采取的酶联免疫法测定药物对HIV逆转录酶的活性是一种比较新颖的筛选HIV逆转录酶抑制剂的方法，这种方法不仅能避免实验过程中同位素的使用，而且高效、特异性好[17-18]。 　　综上所述，OJTPA的抗乙肝病毒及保护肝脏等作用已经被广泛报道，其抗HIV的作用尚未深入研究。由于HBV和HIV复制过程中都涉及到逆转录环节，因此OJTPA的抗HIV逆转录酶的药理作用或许可以为其抗HBV的作用机制研究提供研究思路。此外，本研究也为扩大OJTPA的应用奠定了基础。 　　[参考文献] 　　[1] 黄正明，杨新波，曹文斌，等.水芹抗乙肝病毒机制的研究[J].科学通报，1997，42（8）：1863-1865. 　　[2] 杨新波，刘贺之，曹文斌.水芹提取物对HBV-DNA克隆转染2215人肝细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用[J].解放军药学学报，2002， 18（1）：4-7. 　　[3] Han YQ，Huang ZM，Yang XB，et al. 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