硝化细菌中亚硝酸盐氧化还原酶的研究进展

微生物学通报Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ

ｔｏｎｇｂａｏ＠ｉｍ．ａｃ．ｃｎ

ＮＯＶ

２０，２００８，３５（１１）：１８０６—１８１０

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＡＳ

ｏ２００８ｂｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ

硝化细菌中亚硝酸盐氧化还原酶的研究进展

张星林炜铁’朱雅楠

（华南理工大学生物科学与工程学院广州

５１０００６）

摘

要：亚硝酸盐氧化还原酶（ｎｉｔｒｉｔｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＸＲ）是硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的

关键酶。广泛存在于亚硝酸盐氧化茵中。由于它是可溶性的膜内酶，其催化机理与膜内电子传递密切联系，给它的研究带来了一定的困难。本文综述了多年来国内外研究者从不同方面对ＮＸＲ研究的成果，详细论述了ＮＸＲ的组成结构、工作机理以及不同因子对其活性的影响，总结了近几年应用于研究ＮＸＲ的新方法，并展望了对ＮＸＲ研究的发展方向及其意义．关键词：亚硝酸盐氧化还原酶，催化机理，硝化细菌

ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＮｉｔｒｉｔｅＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｉａ

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硝化作用是由硝化细菌的两个关键共生菌群相互作用来实现的，分别是亚硝化细菌即氨氧化细菌，利用体内的氨单加氧酶和羟胺氧还酶将氨氮转化为亚硝酸盐，氨作为其唯一氮源；硝化细菌即亚硝酸盐氧化细菌（Ｎｉｔｒｉｔｅ．ｏｘｉｄｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＯＢ）利用亚硝酸氧还酶将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，亚硝酸盐作为其唯一氮源¨ｉ。其中亚硝酸盐氧化菌是由进化上截然不同的４类菌构成：硝化杆菌属（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属于变形菌纲的丫亚纲，硝化球菌属（Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ）属于丫亚纲，硝化刺菌属（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｎａ）属于ｐ亚纲、硝化螺菌属（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ）属于硝化螺菌『．－］（ｐｈｙｌｕｍＮｉｔｒｏｓ一

ｐｉｒａ）‘２１。

近几年随着研究的深入，氨氧化菌体内的两种酶被广泛研究并取得了一定的成果，而亚硝酸盐氧化还原酶一步催化反应则未受到广泛重视，国内外对于其作用机制的研究尚处于起步状态。但是，亚硝酸盐氧化细菌在水体治理过程中的作用同样不可忽略。亚硝酸盐氧化菌作为降解水体中对生物体具有毒害作用的亚硝酸盐的关键菌群１３１，对其催化亚硝酸盐氧化还原反应的关键酶的研究具有重要意义。研究其降解效率的调节机制，促进其降解效率提高具有极其重要的理论与实践意义。

・通讯作者：Ｔｅｌ：０２０—３９３８０６０１：民ｗｔｌｉｎ＠１３９．ｃｏｒｎ

收稿Ｉ／ｔ期：２００８—０４．２９；接受日期：２００８－０６．１８

万方数据

张星等：硝化细菌中亚硝酸盐氧化还原酶的研究进展

１

ＮｘＲ概述

亚硝酸盐氧化还原酶（ｎｉｔｒｉｔｅ

ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，

ＮＸＲ）是硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶。但由于其为可溶性酶，又是膜内酶，位于细胞膜靠近细胞质的一侧，它的催化反应与膜内电子传递链紧密相关，因此给ＮＸＲ的研究带来了很大困难。

由于亚硝酸盐氧化还原酶既具有氧化亚硝酸盐的功能性亚基，又具有将硝酸盐还原的功能性亚基，因此它是一个具有多重功能的酶，既可以催化亚硝酸盐的氧化，还可以催化硝酸盐的还原。从能量代谢的角度讲，此酶可以根据氧化还原反应的电势逆向工作。从宏观的角度讲，不同的外界环境可以诱导ＮＸＲ的不同功能，使菌株进入不同的代谢途径，比如缺氧条件下它可将硝酸盐还原【４Ｊ。

由于硝化细菌在进化上的系统发育异源性，其体内所含的亚硝酸盐氧化还原酶也呈现出多态性。通常对亚硝酸盐氧化菌混合培养时，硝化杆菌是其中的优势菌种，故研究者多以硝化杆菌为代表对亚硝酸盐氧化还原酶进行研究。硝化杆菌属又以

Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ⅳ．ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｆ、ｊｖ．口￡一

ｋａｌｉｃｕｓ以及Ⅳ．ｒｕｔ８ｒａｒｉｓ等几种菌较为常见。因此，对ＮＸＲ多态性以及根据ＮＸＲ基因序列分析硝化细菌系统发育也是重要的研究方向。

２

ＮＸＲ的结构与功能

２．１

ＮＸＲ的结构

１９８４年Ｓｕｎｄｅｒｍｅｙｅｒ等人率先从Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ

ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ中分离出了ＮＸＲ。证明了此酶是由３个分子量分别为１１５

ｋＤ、６５

ｋＤ和３２ｋＤ的３种蛋

白构成的【５】。但在接下来的研究中发现，第３种蛋白即分子量为３２ｋＤ的蛋白并不存在于经热处理后的ＮＸＲ中【６１。１９９０年Ｂｏｃｋ等人‘７１的研究证实了Ⅳ．ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｆ以及Ⅳ．ｖｕｌｇａｒ话中的ＮＸＲ具有几乎相同分子量的类似蛋白亚基。１９９８年ＳｐｉｅｃｋＥ等人【８】通过热处理细胞膜将关联膜的整个亚硝酸盐氧化系统从一株Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｍｏｓｃｏｖｉｅｎｓｉｓ中分离出来。电子显微镜观察纯化后的酶显示了大概７

ｎｍｘ９ｎｍ

的均匀颗粒，并识别出了含ｂ型细胞色素的Ｂ亚基类似物，这与硝化杆菌中发现的Ｂ亚基蛋白一致。故通常认为ＮＸＲ是由一个ａ亚基（大亚基）和一个ｐ亚基（小亚基）组成的异源二聚体，两个亚基的Ｍｒ分

万方数据

１８０７

别为ｌ１６ｋＤ（ＮｘｒＡ）和６５ｋＤ（ＮｘｒＢ）。ＮＸＲ复合体还含有铁、钼、硫和铜离子，是一直径大约为９５０±３００的颗粒，其中ＮｘｒＢ的双核中心含无血红素的铁离子。

ＮＸＲ的这种亚基组成和催化硝酸盐还原的能力与异化硝酸盐还原酶非常相似。其中ＮｘｒＡ和ＮｘｒＢ是异养脱氮菌中ＮａｒＧ、ＮａｒＨ多肽的同系物，由硝酸盐还原酶Ａ的大小亚基组成。ＮＸＲ是膜内酶，在细胞膜近胞质的一面，但至今未检测出ＮｘｒＡ和ＮｘｒＢ的信号肽。根据ＴＯＰＰＲＥＤ和ＴＭＰＲＥＤ对其基因序列的分析，可能ａ亚基上有２个或３个跨膜的ａ螺旋转角将ＮＸＲ定位在细胞质膜上【９Ｊ。

２．２

ＮＸＲ的功能

由于传统方法的热处理溶解提取蛋白的方法会

使ＮＸＲ在纯化过程中发生变化，因此越来越多的研究者使用生物信息学方法研究ＮＸＲ，从基因序列推测其蛋白组成、结构以及功能。由于ＮＸＲ基因的多态性，其基因序列在不同菌株中略有差别【１０１，但至少含有２个功能性基因：ｎｘｒＡ和ｎｘｒＢ分别对应大小两个亚基，ｎｘｒＡ约为３０００ｂｐ、ｎｘｒＢ为１５３９ｂｐ，受亚硝酸及硝酸诱导表达１１１１。ｎｘｒＡ和ｎｘｒＢ与大肠杆菌的异化硝酸盐还原酶基因ｎｒＡ、ｎｒＺ的ａ亚基和Ｂ亚基有较高的相似性，在氨基酸序列上分别可以达到６０％和６５％的相似性。由ｎｘｒＢ推测出ＮｘｒＢ含有４个与细菌的铁氧化还原蛋白的铁～硫中心非常同源的半胱氨酸残基串。

２００６年，首个亚硝酸盐氧化菌——Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ．Ｎｂ２５５的全基因组序列得到破译【９】，为通过序列分析研究亚硝酸盐氧化过程提供了充足的信息。研究表明，Ⅳ．ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ中的ｎｘｒ基因簇除了ｎｘｒＡ与ｎｘｒＢ以外还有一个６４８ｂｐ的ｎｘｒＸ基因，推测ｎｘｒＸ基因可能与ＮＸＲ的空间折叠构象有关。ＤＮＡ序列分析表明，它们在染色体上相邻排列：ｎｘｒＡ、ｎｘｒＸ、ｎｘｒＢ，形成一个基因簇。这个ｎｘｒ基因簇和与其相邻的４个其他基因（可能有ＮＸＲ的附属作用）形成了一个操纵子（图１），但其调控机理仍待研究。

ｎｘｒＡ上游的基因编码一种与亚硝酸盐氧化还原有关的ｃ型细胞色素，它还可能是电子传递系统的一部分，电子通过亚硝酸盐氧化还原酶的组分细胞色素ａｌ、ｃ１释放出来，然后改用细胞色素ｃ氧化酶（Ｃｏｘ）穿过细胞色素ｃ５５０【ｌ３１。ＮｘｒＢ的下游，两个

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微生物学通报

２００８．Ｖ０１．３５．Ｎｏ１Ｉ

翟

图１

Ｆｉｇ．１

ｎｘｒ基因簇操纵子【９１

ＮｉｔｒｉｔｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅＣｌｕｓｔｅｒｆ９】

基因编码ＮａｒＪ和ＮａｒＩ这两个与异养脱氮菌的异化硝酸盐还原酶类似的亚基【ｌ２１。ＮａｒＪ是硝酸盐还原酶的８亚基，插入硝酸盐还原酶Ａ的钼辅助因子【ｌ引，可能在ＮｘｒＡ的合成中扮演类似角色。ＮａｒＩ（硝酸盐还原酶的丫亚基）是一个ｂ型细胞色素，作为苯锟的

电子受体和钼辅助因子ｉｆ，亚基的电子供体。Ｎｘｒ族的最后两个基因认为编码类似ＮａｒＫ的硝酸盐／亚硝酸盐运载体和Ｃ４二羟酸／苹果酸或碲的运载体。ＮａｒＫ是一个运载体的主要推进子超家族的膜，有报道认为它是一个Ｎ０３一Ｈ共输送体，一个Ｎ０３一Ｎ０２反向转运体，一个亚硝酸盐单输送体。亚硝酸盐的主动吸收或硝酸盐的输出对于维持ＮＸＲ的工作效率非常重要，其作用机制仍有待研究。

３

ＮＸＲ的工作机理

亚硝酸氧化菌将Ｎ０２－氧化为Ｎ０３一，产生ＡＴＰ

和ＮＡＤＨ，并通过卡尔文循环固定Ｃ０２。亚硝酸盐氧化还原酶（ＮＸＲ）催化亚硝酸氧化为硝酸，通过呼吸链的氧化磷酸化产生还原剂（ＮＡＤＨ）。原子示踪实验证明亚硝酸盐好氧氧化过程中，产物硝酸盐中的氧原子来自于水。亚硝酸氧化酶（ＮＸＲ）位于细胞的呼吸颗粒上，与膜紧密结合，因为能量的需要，参与此过程的细胞色素不是Ｃ型，而是ａ型，整个体系称为“亚硝酸氧化酶”，整个反应至今未检出任何中间产物，是一步完成的（图２）ｌｌ”。

这种利用无机物的化能自养代谢过程，各反应的还原电势都比较高：Ｅ’（Ｎ０２－／ＮＨ４＋）＝３４０

ｍＶ，

Ｅ‘（Ｎ０３－／Ｎ０２－）＝４３０ｍＶ，因此欲使无机基质的氧

化和ＮＡＤ的还原相偶联，必须提供一定的能量，而细菌的氧化磷酸化效率很低，ＮＡＤ还原过程产生１分子ＮＡＤＨ需消耗３分子ＡＴＰ，然而实际情况是氧化１分子亚硝酸盐只产生１分子的ＡＴＰ，因此为获得合成细胞所需的还原力，必须消耗大量ＡＴＰ，这就是硝化细菌生长慢、世代时间长、细胞产率低的原因。

ｈ竹ｐ：／／ｉｏｕｍａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ／ｗｓｗｘｔｂｃｎ

万方数据

ＩＩ，Ｏ＋ＮＯ，

Ｎ０３藤点Ｆｏ：，莱ｙｙ誊

图２亚硝酸盐氧化过程的电子传递示意卧１５１

Ｆｉｇ．２

Ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｓｋｅｔｃｈｍａｐｏｆｎｉｔｒｉｔｅｏｘｉｄａｔｉｏｎ【１５】

４环境因素对ＮＸＲ的影响

ＮＸＲ是与膜偶联的酶，一旦分离出细胞膜即失去了酶活性，敌对ＮＸＲ酶催化氧化反应活性的研究

至今仍以亚硝酸盐氧化菌降解亚硝酸盐的能力来

表达。

４．１抑制剂的影响

硝化反应的主体和反应中间产物，如游离氨、亚硝酸盐、硝酸盐，都会对硝化反应产生抑制作用，其中被研究者们广泛认可的是游离氨（ｆｒｅｅ

ａｍｍｏｎｉａ，

ＦＡ）。早在３０年前Ａｎｔｈｏｎｉｓｅｎ等人就指出ＦＡ和游离亚硝酸（ＦＮＡ）对硝化反应有抑制作用，并且这种抑制受到ｐＨ值、温度等的影响。之后有很多研究者考察和验证了ＦＡ的这种选择性抑制作用，不过对ＦＡ的浓度有不同的结果。在ＦＡ对亚硝态氮聚集影响的研究中，一个值得注意的问题是亚硝酸盐氧化菌对这种抑制的适应性。研究发现，亚硝酸盐氧化菌虽然较氨氧化菌对ＦＡ的抑制作用敏感，但在长时间与游离氨接触后，可产生适应性从而使受到抑制的代谢系统得到恢复。最新的研究中，ＶｅｌＭＶａｄｉｖｅｌｕ等人【ｌ们使用一种新的研究方法，解除了菌体生长和能量代谢间的偶联关系，通过对硝化杆菌富集培养过程中化学量的监测得出，游离氨对菌体硝化作用的抑制非常明显，另一项实验证实了是ＦＮＡ而非亚硝酸盐对菌体能量代谢有明显的抑制作用【１７１。

张星等：硝化细菌中亚硝酸盐氧化还原酶的研究进展

亚硝酸盐通过ＮＸＲ的氧化是可逆的，而且ＮＸＲ可以催化硝酸盐还原为亚硝酸盐；这种转化被认为是维氏杆菌执行脱氮作用（反硝化作用）路径的一部分。但硝酸盐和亚硝酸盐对ＮＸＲ的调控并不是简单的底物诱导和产物抑制，ＮＸＲ的催化方向受到外界环境因素尤其是溶氧量的影响。对于自养型亚硝酸盐氧化菌，亚硝酸盐是降解ＮＡＤ的电子供体，它能够倒转电子流并通过氧化磷酸化产生ＡＴＰ，有机化能型的菌株生长比亚硝酸盐作为能量来源时明显减慢。而对于兼性异养的亚硝酸盐氧化菌Ⅳ．ｗｆ．ｎｏｇｒａｄｓｋｙ在缺氧或碳源不足的条件下更容易形成降解硝酸盐的短程硝化代谢回路１４］。４．２环境因子的影响

环境因子变化对硝化能力也有不容忽视的影响。１９９９年王歆鹏等人【ｌ８Ｊ研究了不同环境因子变化对硝化菌群的增殖能力及其对硝化作用活性的影响，认为温度、ｐＨ、供氧状况、无机碳源浓度等对于硝化细菌菌群的增殖能力及硝化作用活性具有较重要的影响，而含盐量高低几乎无影响。２００５年，琚姝等人【ｌ９】对一株亚硝酸盐氧化菌做了详细的研究，实验得出菌体生长的最适ｐＨ值为８．０～８．５，在适宜的氮、碳源条件下，经过９ｄ的培养能够收获４．６ｘ１０９ＭＰＮ／ｍＬ浓度的菌体。培养１８ｄ后，培养基中

４．０５ｘ１０４

ｍｇ／Ｌ的ＮａＮ０２可完全转化为Ｎ０３一。ＮａＣｌ

含量在０．５％以下、葡萄糖含量在０．１％以下时对菌体生长不构成影响。２００５年陈旭良等人【２０ｌ剖析了ｐＨ对生物硝化的影响以及与碱度的关系，认为ｐＨ不仅影响硝化细菌的生长和代谢，也影响硝化基质和产物的有效性和毒性，可制约生物硝化反应器的效能。生物硝化系统的碱度主要由碳酸盐类组成，因为碳酸盐系统在ｐＨ６．５～８．５时缓冲强度较弱，硝化过程中极易发生ｐＨ大幅度波动，操作中应予以高度关注。２００７年ＴｙｓｏｎＲＶ等人研究了培养基中各营养成分、硝酸盐以及ｐＨ对硝化速率的影响【２１１。Ｋｉｍ等人结合ＦＩＳＨ技术鉴定硝化细菌种群分布，研究了温度和游离氨对垃圾渗出液中硝化作用和亚硝酸盐累积的作用【２２１。

ＮｘｒＢ的双核中心含无血红素的铁离子而非铜

离子，且ＮｘｒＢ中有４个谷氨酸残基用来协调无血红

素铁配基，故铁离子对ＮＸＲ的降解效率也应有相当大的影响【２３１。钼是在由氨氮氧化为亚硝氮的过程中对其关键酶有极其明显的影响作用，有研究表明亚硝酸盐氧化酶的活性也依赖于钼的存在【８１。

万方数据

１８０９

５展望

随着生物技术的发展，新的研究方法不断应用于ＮＸＲ的研究。Ａａｍａｎｄ等人阱１制备出３种针对硝化杆菌中ＮＸＲ的单克隆抗体：ｈｙｂｌ５３．１和１５３．３可识别分子量为６４ｋＤ的蛋白即Ｂ亚基，１５３．２能识别分子量１１５ｋＤ的蛋白即Ｕ亚基，开创了免疫分析法鉴定ＮＸＲ蛋白的方法。靶标为ＮＸＲ基因序列的ＰＣＲ技术也逐渐成熟，并与ＤＧＧＥ等其它分子生物学技术相结合，用于研究系统发育【２５１以及种群结构中亚硝酸盐氧化菌的定性与定量【２６１。最近Ｌｉ的研究，以解决亚硝酸盐氧化菌生长缓慢酶浓度低带来的困扰。

目前，水体的富营养化已经成为世界环境最为突出的问题之一，利用硝化细菌代谢分解含氮有害物质已成为世界公认最经济最有效的绿色途径之一。但由于ＮＸＲ的特殊性，对其主要研究仍停留在定性定量的工作上，对于其氧化还原反应具体作用机理及过程仅有一些国外研究者提出的猜想与假设，至今未能有充分的解释，因此也给提高亚硝酸盐氧化酶活性带来难度。为此，笔者认为应该从以下几个方面加强对ＮＸＲ的研究：

（１）ＮＸＲ的亚基组成已确定，但其三维结构以及与铁、钼等辅助因子的结合形式仍不甚清楚。Ｘ射线衍射晶体结构分析法是研究蛋白质三维结构的最主要手段，可用以测定酶的高分辨率三维结构，并通过与底物类似物结合形成复合物的结构分析来研究ＮＸＲ与辅助因子的结合形式。

（２）利用先进的分子生物学技术以及生物信息学的方法，从基因序列的层面进行分析，对ＮＸＲ基因的转录、翻译以及酶合成的调节机理进行更深入的研究具有重大的理论意义。（３）从宏观上进一步研究各种环境因子和抑制剂对ＮＸＲ活性影响，以及产生影响的原因，从微观上探讨酶与底物分子的相互识别及其催化机理。以期找到提高酶活性的最有效途径。（４）作为复杂的多功能酶，ＮＸＲ既具有氧化能力又具有还原能力，若能精确控制其催化能力则应用价值倍增，故应加强应用方面研究，以期找到人工诱导其不同功能发挥的最适条件。作为降解有毒物质亚硝酸盐的关键酶，ＮＸＲ不Ｊｕｎ．Ｗｅｎ等人【２‘¨将ＤＮＡ．Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ技术应用于ＮＸＲ仅已应用于水体污染综合治理，以及养殖水体防止

１８１０

微生物学通报

２００８，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．１１

鱼虾中毒，更可应用于人类的食品饮品中去除亚硝酸盐。因此，对ＮＸＲ的基础研究，不仅开拓了膜内酶的研究先例，有着重要的理论意义，更为今后能够更好地利用该酶为人类生产生活做贡献打下理论基础。

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ｔｒｏｎ

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ｆｉｌｌｌｅａｃｈａｔｅ

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ｏｇｎｉｚｉｎｇ

ｎｉｔｒｉｔｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｏｆ

Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｈａｍｂｕｒ－

ｇｅｎｓｉｓ，ＮｗｉｎｏｇｒｎｄｓｋｙｆａｎｄＮｖｕｌｇａｒｉｓ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉ・

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ａ１．Ｔｈｅ

ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ

ｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｂａｓｅｄｏｎ

ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｒｅｐ—ＰＣＲ，

１６Ｓ

ｒＲＮＡ

ａｎｄｎｉｔｒｉｔｅ

ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ

ａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＡｐｐｌｉｅｄ

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，３０

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【２６】ＷｅｒｔｚＳ．ＰｏｌｙＦ，ＬｅＲｏｕｘＸ，ｅｔａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐ－

ｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａ

ＰＣＲ—ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｔｏｏｌ

ｔｏ

ｓｔｕｄｙｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ－ｌｉｋｅ

ｎｘｒＡ

ｓｅ．

ｑｕｅｎｃｅｓｉｎｓｏｉｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００８，６３（２）：

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ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆ

ｎｉｔｒｉｔｅｏｘｉｄｏ．ｒｅｄｕｃｔａｓｅｂｙ

ＤＮＡ．ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．

Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｎｄ

Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ

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１ｌｌ—１１８．