组合微生物利用发酵秸秆产乳酸效果的研究

120—125草业学报第19卷第6期

V01.19,No.62010年12月ACTAPRATACUI。TURAESINICA

组合微生物利用发酵秸秆产乳酸效果的研究

徐娟娟1’2,葛春梅2,孙芹英2,张洁2,樊美珍¨,潘仁瑞2

(1.安徽农业大学微生物防治省重点实验窜,安徽合肥23003612.合肥学院生物与环境工程系。安徽合肥230022)

摘要:为了更好的利用毛米芯、玉米秸秆等农业废弃物,提高其综合利用率,减少传统化学方法及秸秆焚烧过程造

成的环境污染,试验采用里氏木霉与鸡腿菇混合发酵产粗酶液降解秸秆等废弃物,再利用米根霉将废弃物转化为

乳酸。此试验中以商品纤维素酶处理的玉米芯及秸秆为对照进行乳酸发酵试验。鸡腿菇与里氏木霉按5:2的接

种比例,接种时间间隔为12h,在26℃,150r/min培养3d,此时漆酶酶活比鸡腿菇单独发酵酶活提高106%。用以

上两菌混合发酵3d的粗酶液在50℃,pH5.0,120r/min下酶解原材料84h,酶解得率为55.2%,米根霉再转化酶

水解液产乳酸量为3.69g/L。糖酸转化率为67.40%。

关键词:秸秆;L-乳酸;里氏木霉;鸡腿菇;米根霉;共发酵

中图分类号:S816.6文献标识码:A文章编号:1004-5759(2010)06—0120-06

我国每年农作物秸秆产量达7亿t之多[1],其中玉米秸秆2.2亿t,估算每年有近90%的纤维素资源不能被利用,多数被白白地烧掉,不仅浪费资源,而且还严重的污染环境。因此,合理开发和科学利用这一丰厚天然资源是各国政府及科学家一直致力于、且投人大量人力及资金进行研究和开发的重点领域比]。近几年国内外科研人员利用物理、化学的方法处理农业废弃物秸秆,但其利用不充分、成本高是障碍。采用微生物降解法利用秸秆,具有降解率高、安全环保和成本低等优点。自然界中存在许多微生物可以腐蚀和分解秸秆、树叶及树木等高纤维物质,这些微生物包括细菌、霉菌、酵母菌及食用菌等【3】。

乳酸广泛存在于人体、动植物和微生物中。早在1841年,Boutron和Fremy就采用自然发酵生产乳酸[4巧]。乳酸及其盐类和衍生物可用于食品、酿造、医药、皮革、卷烟、化工和印染等工业[6],L一乳酸聚合而成的聚乳酸具有生物降解性和生物相容性被广泛用于生产可生物降解塑料。目前,L一乳酸的生产主要采用葡萄糖、淀粉为原料,成本较高,限制了I,乳酸的应用。

随着人口迅猛增长,能源与环境压力日益增大。世界各国均不遗余力地调整农业结构,降低环境与市场风险,满足人民对食物数量和质量的需求[7]。我国是一个农业大国,具有丰富的纤维素资源,是一个有待进一步开发的巨大宝库。以麦秆为例,其中纤维素和半纤维素的含量在60%以上,其基本单元组成为葡萄糖、木糖等糖类。目前,农作物秸秆绝大部分被自然腐败或燃弃,不仅浪费了宝贵的资源,而且造成了环境的污染。围绕降低L一乳酸的生产成本,选择廉价、广泛的纤维素为原料生产L一乳酸成为研究热点之一【8.9]。

本研究以里氏木霉(Trichodermareesei)、鸡腿菇(Coprinuscomatus)混合发酵产粗酶液降解秸秆等农业废弃物,并利用米根霉(Rhizopusoryzae)进一步将其转化为乳酸,确定了混合发酵产粗酶液处理玉米秸秆等农业废弃物的工艺条件。同时采用商购纤维素酶与混合发酵所产粗酶液处理玉米秸秆等农业废弃物进行乳酸发酵的结果进行了对比。试验结果表明,以玉米秸秆、玉米芯等农业废弃物为原料,采用微生物混合发酵产乳酸是可行的,为处理农业废弃物提供一个可供参考的生物学方法。

1材料与方法

1.1材料

玉米芯,秸秆,麸皮,购自肥西县郊区。鸡腿菇和米根霉为合肥学院微生物和环境工程实验室保存菌种.里氏收稿日期:2009—11-09;改回日期:2010一Ol一08

基金项目:安鬣省自然科学基金项目(070413266X).安徽省教育厅优秀人才基金(2009SQR2162)。合肥学院博士基金项目(R【’0016)和合肥

学院n然科学基金项目(09KYlIZR)资助.

作者简介:徐娟娟(1984一).女,安徽淮南人,在读硕士。E-mail:xuiuaniuanl014@163.tom-通讯作者。E-mail:mafan@ahau.edu.ca

第19卷第6期草业学报2010年

木霉购自中国菌物保藏中心。

1.2试验方法

1.2.1试验设计组合微生物的筛选:试验对多种降解秸秆的白腐真菌及里氏木霉与黑曲霉等进行平板相容性及产酶试验分析,得鸡腿菇和里氏木霉共培养组合良好,在两菌生长交界处,滴加愈创木酚,显示交界区漆酶分泌超过单独鸡腿菇分泌[1…。

里氏木霉与鸡腿菇混合培养条件的优化:以液体发酵产酶培养基(40目玉米芯4g,40目玉米秸秆2g,40目麸皮1g,改良的mandels盐…]57.75%,装液量120mL/250mL三角瓶)为基础培养基。设计不同的接种比例,接种顺序,接种时间等,对里氏木霉与鸡腿菇混合发酵产酶条件进行优化。最优培养条件为:26℃,150r/min,pH5.0,发酵3d。

粗酶液酶解原材料试验:里氏木霉与鸡腿菇在最优条件下发酵3d的粗酶液,在不同条件下酶解玉米芯及玉米秸秆,采用生物传感器法(SBA一40C葡萄糖一乳酸生物传感器分析仪)测定水解糖含量,选择最优水解条件。最后确定酶解最适条件为:50℃,120r/min,pH4.8,酶解84h。

发酵产酸试验:向酶解基质中补加供米根霉生长的无机盐,灭菌,取长满孢子的米根霉斜面,用无菌水洗下孢子,最后接种米根霉孢子悬浮液(1.2×107个孢子/mL)1mL于发酵产酸培养基[50mL酶水解液装入250mL三角瓶,(NH。)2S040.3%,ZnSO。0.02%,KH2PO。0.03%,MgSO.0.075%,足量CaCO。(单独灭菌)]中。培养条件:36oC,200r/min,48h。

以上试验在2008年2月一2009年8月进行,均设至少3个重复。

1.2.2酶活力的测定方法纤维素酶酶活的测定[IZ-143:取适当稀释的粗酶液0.5mL,加入1mL1%的羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethylcellulose,CMC—Na)溶液(溶于pH为4.8,浓度为0.1mol/L的HAc-NaAc缓冲液中),50℃保温30min,加入3mL3,5一二硝基水杨酸(3,5一dinitrosalicylicacid,DNS)溶液,沸水浴5min,冷却后加水稀释至25mL,分光光度计调至520am处测定吸光度,并计算生成葡萄糖的质量。

木聚糖酶酶活的测定m“乳16]:取0.1mL适当稀释的粗酶液,加入0.1mL2%桦木木聚糖溶液(用0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲液配制,pH4.6),在50℃保温15min后,加入0.6mLDNS溶液,煮沸10min灭活显色,定容到5mL,550nm波长下测定还原糖量(以木糖计),以灭活的酶液作为对照。

漆酶酶活的测定:采用ABTS法m],酶活单位定义为每min氧化1Mmol2,2’连氮一二(3一乙基苯并噻唑一6一磺酸[2,2'-azinobis一(3一ethylbenzthiazoline-6一sulphonate,ABTS-I所需的酶量为一个酶活单位。

1.2.3酶水解方法取10g粉粹的玉米芯和秸秆(两者比例为1。1),置于250mL三角瓶中,加入120mL的缓冲液和2mL浓度为750u/g的纤维素酶液,在50"C,100r/min恒温水浴锅中反应24h。酶水解产物经离心得到的上清液即为酶水解糖液。

将10g粉碎的玉米芯和秸秆(两者比例为1。1)/m入鸡腿菇和里氏木霉混合发酵3d后过滤得到的粗酶液中,设定不同酶解条件,水解,离心后得酶水解糖液。

1.2.4总糖、葡萄糖和乳酸的分析方法使用SBA一40C葡萄糖一乳酸生物传感器分析仪,测定葡萄糖和乳酸含量。

总糖的测定:8%的硫酸和秸秆酶解液以1。1混合后在121℃下保温1h,取适当稀释的液体0.5mL,用DNS法测()D。:。。计算总糖的含量。

1.2.5计算公式

酶解得率[93(%)=[酶解液中糖量(g)/试样秸秆质量(g)]×100

糖转化率(%)一[(初始糖量一终止糖量)/初始糖量]×100

糖酸转化率(%)=[乳酸含量(g/L)/总糖量(g/L)]×100

2结果与分析

2.1最优条件下鸡腿菇和里氏木霉混合发酵随时间变化产酶情况

按5t2的接种比例同时接种鸡腿菇和里氏木霉,在26℃,150r/min条件下发酵产酶,其酶活力随时间变化

122ACTAPRATACULTURAESINICA(2010)V01.19。No.6结果如图1,漆酶活力在发酵第3天达峰值,其活力为

3276.2十纤维素酶CMCase+漆酶Laccase4OU/mI。,随后逐渐下降,随着漆酶活性的下降,3

l∞如∞OO0O纤维素酶和木聚糖酶酶活力逐渐升高,第8天达峰值,分别为101.7和167.9IU/mL。漆酶活力峰值出现较早,用于降解木质素结构,破坏秸秆的木质纤维素结构,暴露出纤维素和半纤维素,发酵后期纤维素酶和半

纤维素酶达到峰值,更有利于对秸秆的降解。混合发

酵中产生的漆酶活力比单独发酵(1593.5∞∞如OOlU/mI。)提∞如0

024R烬嚣蹬O高了106%,而产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活力比

里氏木霉单独发酵产酶有所下降,比鸡腿菇单独发酵

产纤维素酶有所提高(图1,2)。从产酶的时间来看,

混合发酵产生的漆酶酶活峰值比单独发酵提前3d,后

2种酶酶活峰值则有延迟现象。68101214时间Time(d)图1优化条件下混合发酵产酶过程Fig.1Optimalconditionofliquid-statemixedfermentationproducedenzymaticperiod

-.43-纤维素酶CMCase+漆酶Laccaso

昌,1

50R烘避蹬0R蜒苗缝

O2468lO1214

时间Time(d)

图2鸡腿菇单独(a)和里氏木霉单独(b)发酵产酶情况

Fig.2ProductionofenzymesfromCcomatus(a)orLreesei(b)singlefermentation

2.2混合发酵粗酶液对秸秆等的降解条件的研究

表l

Tablel2.2.1摇床转数对粗酶液水解原材料程度的影响里氏木霉与鸡腿菇混合发酵3d后得到的粗酶液在不

同的摇床转数(80,100,120,140r/min)条件下进行酶

解原材料78h。水解得葡萄糖的含量结果见表1,当摇转数对酶解反应的影响revolutiononEffectofenzymaticreaction项目Item80

2.68转数Revolution(r/rain)1002.781203.341402.81床转数为120r/min时,得到酶解液中葡萄糖含量较

高,为3.34g/L,说明粗酶液酶解底物的过程中酶与底葡萄糖含量Glucontent(g/L)

物的接触程度及作用时间对底物的水解有一定的影响,120r/rain条件下底物与酶能够充分接触,对底物水解效果较好。

2.2.2粗酶液水解原材料的最佳温度混合发酵3d的粗酶液在不同的温度(40,45,50,55℃)下酶解。在50℃下酶解得到葡萄糖含量较高,酶解78h时葡萄糖含量为2.62g/L(图3)。酶解过程中,葡萄糖含量均呈先上升后下降的趋势,下降的原因可能是酶解过程中微生物利用了水解糖作为直接碳源而被消耗。

2.2.3不同pH对粗酶液酶解原材料的影响Ds.19]用混合发酵3d的粗酶液在不同pH(4.6,4.8,5.0,5.2)下酶解原材料78h,葡萄糖含量随时间变化的结果见图4,粗酶液酶解秸秆的最适宜pH值为4.8。

第19卷第6期

35

3O

25

2O

l5

lO

O5草业学报2010年2.5d3_a2O里盎oUl5三0O

2454667890删钿姆龌掘lOO5O4.64.8

pH5.05.2时间Time(h)

图3温度对酶解反应的影响

Fig.3Effectoftemperatureon田4Fig.4pH值对酶解反应的影响onenzymaticreactionEffectofpHenzymaticreaction

2.3米根霉利用秸秆水解液发酵产L一乳酸

2.3.1纤维素酶水解物发酵产L一乳酸商购纤维素酶液,在50℃,120r/min下酶解84h,测葡萄糖含量,补加营养盐接种米根霉在36.5℃,200r/rain发酵48h,测乳酸含量。商购纤维素酶酶解玉米芯秸秆得还原糖(以葡萄糖计)平均为1.86g/L。糖酸转化率平均为38.6%,发酵产L一乳酸的量平均为0.36g/L(表2)。

2.3.2混合发酵粗酶液水解物发酵产乳酸混合发酵产混合粗酶液酶解玉米芯秸秆得总糖和还原糖(以葡萄糖计)含量平均分别为5.52和3.36g/L,糖酸转化率平均为67.40%,发酵产L-乳酸平均为3.69g/L(表2),得到乳酸含量比所测葡糖糖完全转化成乳酸值高,说明该米根霉菌株可以转化木糖为乳酸[I9。。

衰2不同酶液酶解原材料产糖产酸结果

Table2Resultoflacticacidandglucoseproductionfromdifferentenzymeliquid

商品化纤维素酶组分单一,仅能作用于纤维素成分,糖水解得率较低;鸡腿菇和里氏木霉混合发酵粗酶液虽然酶浓度低,但酶组分较多,可以作用于秸秆中的多种组分,如漆酶,可以作用于木质素,破坏木质素结构,暴露出更多的纤维素和半纤维素结构,能使酶与底物的接触更加充分,秸秆水解率提高。

3讨论

为了加快秸秆等物质的快速转化,充分利用环境中的农业可再生资源.微生物之间的相互作用成为目前研究的热点。混合菌培养周期短,某些微生物组合性能稳定,可获得某些新型的或优质的发酵产品,产率高,且在防治杂荫污染方面很占优势¨…。

目前,已有利用秸秆纤维素类物质生产I。一乳酸的报道[2卜23|,但是发酵之前都对天然纤维素进行了不同程度的化学预处理,对环境又造成了二次污染,且最终转化率较低。本试验前后一共经过2次液体发酵(72h液态产酶发酵+酶解84h+液体发酵产酸48h),步骤简单.周期短,对环境无任何污染.较好的解决了秸秆纤维素生物质资源的利用问题[6]。

里氏木霉和鸡腿菇混合发酵产生纤维紊酶和木聚糖酶活性和里氏木霉单独发酵相比变化不大,漆酶的活性比鸡腿菇单独发酵提高106%,且产酶时间提前至3d。混合酶液能很好的降解秸秆中的木质素,使秸秆紧密的结构变得疏松,利于纤维素半纤维索的降解。里氏木霉和鸡腿菇混合发酵3d的粗酶液在50℃,pH4.8,120

124ACTAPRATACUI,TURAESINlCA(2010)V01.19。No.6r/min水解玉米芯、玉米秸秆84h,酶解总糖得率为55.2%,再利用米根霉转化水解物生成L-乳酸,L一乳酸产量为3.69g/L,糖酸转化率达67.40%。

本试验时间进程跨度较大,外界因素,例如原材料成分中杂质,培养温度等对产酶有一定的影响,直接关系到酶解得率。进一步影响米根霉利用水解糖产酸的量,再者由于米根霉产酸速率对温度的变化非常敏感,存在一个最适的培养温度,超过或低于最适温度都会使产酸速率迅速下降[2引。

本试验所用米根霉菌株是经诱变所得,具有转化六碳糖生成乳酸的稳定性质,但转化五碳糖(主要是木糖)的性质不稳定,其产酸量与古绍彬等瞳51利用经离子注入诱变的米根霉菌种R3303直接利用葡萄糖发酵产I。一乳酸的量及王冬梅等[61利用玉米芯发酵产乳酸的量(7g/I。)有一定差距,需要进一步驯化,得到性质稳定的高效利用秸秆的菌株。

本试验以农业废弃物为原料,通过微生物混合发酵制取L-?L酸,提取乳酸后的残余物含有较高的菌体蛋白,多种氨基酸、有机酸作为饲料【26’27|,可以提高适口性。这种模式可以较好的利用农业废弃物质,减少环境污染,但是乳酸产量低,生产过程较为复杂,仍控制着这种生产方法的实际可行性,仍有很多工作需要继续研究。

试验结果说明,以玉米秸秆、玉米芯等农业废弃物为原料,采用微生物混合发酵产乳酸是可行的,为处理农业废弃物提供一个可供参考的生物学方法,为提高农业废弃物综合利用提供又一可行性思路。

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Effectsofcombinationsofmicroorganismsonlacticacidproductionusingfermentationstraw

XUJuan-juanl’2,GEChun—mei2,SUNQin—yin92,ZHANG—Jie2,FANMei—zhenl,PANren—rui2(1.AnhuiProvincialKeyLaboratoryofMicrobialPestControl,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei

230036,China;2.DepartmentofBiology&EnvironmentEngineering,Hefei230022。China)

Abstract:ThisstudyinvestigatedtheproductionofligninaseandL—lacticacidfrommixedfermentationwithTrichodermareesei,Coprinuscomatus,andRhizopusoryzae.Underoptimalconditionswith

proportionofC.comatus

inoeubationfor3dattoaninoculationT.reeseiof5:2。atimeintervalof12h,shakerotationspeedof150r/min。afterto26。C,thelaccaseactivityreached3267.1U/mL,anincreaseof106%comparedsinglecultures.Theagriculturalwastesweretreatedfor84hwithcrudeenzymesextractedfromthemixedfermenta—tionofT.reeseiandC.comatus

obtained.TheatpH5.0,50"Cwithashakingspeed120r/min:A55.2%hydrolysisratewashydrolysedsugarwastransformedintoL—lacticacidbyR.oryzaP.UnderoptimalcOnditions.

rate3.36g/LL—lacticacidwasproducedandthesugarconversionreached67.40%.

Keywords:straw;L—lacticacid;Trichodermareesei;Coprinuscomatus;Rhizopusoryzae;c0一fermentation

组合微生物利用发酵秸秆产乳酸效果的研究

作者:

作者单位:徐娟娟, 葛春梅, 孙芹英, 张洁, 樊美珍, 潘仁瑞, XU Juan-juan, GE Chun-mei, SUN Qin-ying, ZHANG-Jie , FAN Mei-zhen, PAN ren-rui徐娟娟,XU Juan-juan(安徽农业大学微生物防治省重点实验室,安徽合肥230036;合肥学院生

物与环境工程系,安徽合肥230022), 葛春梅,孙芹英,张洁,潘仁瑞,GE Chun-mei,SUN Qin-

ying,ZHANG-Jie,PAN ren-rui(合肥学院生物与环境工程系,安徽合肥,230022), 樊美珍

,FAN Mei-zhen(安徽农业大学微生物防治省重点实验室,安徽合肥,230036)

草业学报

ACTA PRATACULTURAE SINICA

2010,19(6)刊名:英文刊名:年,卷(期):

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