天根质粒小提中量试剂盒 说明书
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Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD版本号: DP140918
TIANprep Mini Plasmid Kit II
质粒小提中量试剂盒
(离心柱型)
目录号:DP106
产品内容
产品组成 (50 preps)
平衡液BL (Buffer BL) 溶液P1 (Buffer P1) 溶液P2 (Buffer P2) 溶液P3 (Buffer P3) 去蛋白液PD (Buffer PD) 漂洗液PW (Buffer PW) 洗脱缓冲液EB (Buffer EB) RNase A (10 mg/ml) 吸附柱CP4 (Spin Columns CP4) 收集管(2 ml) (Collection Tubes 2 ml) 30 ml30 ml30 ml40 ml30 ml15 ml15 ml300 μl50个50个
储存条件
该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间,必要时可在37℃水浴中预热10 min,以溶解沉淀。第一次使用前将RNase A加入溶液P1中,混匀后置于2-8℃保存,可稳定保存12个月以上。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月以上。
本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
产品简介
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料,高效、专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。以下操作步骤适用于提取5-15 ml过夜培养的大肠杆菌,质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件,细胞的裂解,质粒拷贝数,质粒的稳定性,抗生素等因素有关。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。
提取得率
质粒类型 低拷贝 高拷贝 菌液量 5-15 ml 5-15 ml 得率 质粒 pBR322, pACYC及其衍生载体,5-25 μg pSC101及其衍生载体,SuperCos, pWE1515-70 μg pTZ, pUC, pBS, pGM-T 注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
溶液P1在使用前先加入RNase A混匀,置于1.
2-8℃保存。
使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加2.
热几分钟,即可恢复澄清。
注意不要直接接触溶液P2和P3,使用后应立即盖紧盖子。3.
所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm (~13,400×g )。4.
提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或5.
大于10 kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,洗脱缓冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。实验前使用平衡液处理吸附柱,可以最大限度激活硅基质膜,提高得率。6.
用平衡液处理过的柱子最好当天使用,放置时间过长会影响效果。7.
去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白杂质,当宿主菌为endA+(TG1、BL21、HB101、8.
ET1256、JM101等)核酸酶含量较高的菌株时,强烈推荐使用去蛋白液PD。
操作步骤
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。
1. 柱平衡步骤:向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl的平衡液BL,12,000 rpm
(~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中请使用当天处理过的柱子)
2. 取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,尽量吸
除上清。
注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳,菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A),使用
移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。4. 向离心管中加入500 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮,可能是由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
5. 向离心管中加入700 μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色
絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min,此时在离心管底部形成沉淀。注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
6. 将上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中,其容量为750-
,注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
7. 可选步骤:向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,
倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4重新放回收集管中。
如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21, HB101,JM101, ET12567等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。
8. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm
(~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
9. 重复操作步骤8。
10. 吸附柱CP4放入收集管中,12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min,目的是将吸附柱中残余
的漂洗液去除。
注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP4开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11. 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓
冲液EB,室温放置2-5 min,12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min,将质粒溶液收集到离心管中。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于100 μl,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序,需使用ddH2O做洗脱液,并保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,再次离心。质粒DNA浓度及纯度检测
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带,也可能为2到3条DNA条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml 双链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用ddH2O,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值。
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