人肝癌细胞膜离子通道特性研究

北京医科大学学报

JOURNAL OF BEIJING MEDICAL UNIVERSITY

1998年4月 第30卷 第2期

人肝癌细胞膜离子通道特性研究

傅 卫 张宗明 周培爱△ 吴才宏△ 周孝思

(北京医科大学第三医院外科，北京 100083 △北京大学生物膜与膜生物工程

国家重点实验室)

主题词 肝肿瘤/代谢 细胞膜/病理生理学 癌，肝细胞/代谢 离子通道

摘 要 目的：研究人肝癌细胞系BEL-7402细胞膜离子通道特性。方法：膜片钳技术的全细胞记录方式。结果：人肝癌细胞系BEL-7402细胞获得稳定高阻封接的最佳培养时间是细胞传代培养72 h，细胞的静息膜电位为（－22.2±－2.8）mV, 几乎每一次记录都发现相似的跨膜电流，该跨膜电流具有电压依赖及不失活特性，翻转电位在－80～－60 mV, 能被已知的K ＋通道阻断剂阻断。结论：在人肝癌细胞系BEL-7402细胞膜上存在类似于神经元和肌肉细胞的延迟整流性K ＋通道。

中国图书资料分类法分类号 R735.7

THE STUDY OF ION CHANNEL CHARACTER OF THE

HUMAN HEPATOCYTE CARCINOMA CELLS

FU Wei＃, ZHANG Zongming, ZHOU Peiai, WU Caihong, ZHOU Xiaosi (＃Department of Surgery, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing

100083)

MeSH Liver neoplasms/metab Cell membrane/physiopathol Carcinoma, hepatocellular/metab

Ion channel

ABSTRACT Objective: To study ion channel character of the human hepatocyte carcinoma cells of cell line BEL-7402. Methods: The whole-cell recording mode of patch clamp technique. Results: The optimal culture time of forming a successful high-resistance seal was 72 hours from the subculture. The resting potential was (－22.2±－2.8) mV. The records of transmembrane current from most cells were similar to each other. The current had voltage-dependent and non-inactivating character. The reversal potential was between －80 mV and －60 mV. The current was blocked by the well-known K+ channel blocker. Conclusion: The

transmembrane current bore a resemblance to the delayed rectifier potassium current

of neuron and muscle cells.

(J Beijing Med Univ, 1998,30:115)

膜片钳技术是新近发展起来的研究可兴奋细胞的电生理技术［1］，利用膜片钳技术研究非可兴奋细胞的离子通道及离子通道在细胞增殖中的作用越来越受

［～］到重视24。本实验旨在研究人肝癌细胞膜离子通道特性，并为进一步研究离子通道在肝癌细胞增殖中的作用奠定基础。

1 材料与方法

细胞系：人肝癌细胞系BEL-7402由北京医科大学药学院药学及化学分析中心赠送。

主要仪器：电极拉制器(Narishige,PP-83,Japan)，玻璃电极毛胚(Would

Precision, U.S.A.)，倒置显微镜、微操纵器(Narishige, Japan)，EPC-7膜片钳放大器(List, Germany)，5.5.1版PClamp 电信号采集程序、TL-1接口、Labmaster DMA数据采集系统(Axon Instrument Inc, U.S.A.)

主要试剂：4-氨基砒啶(4-AP),氯化铯(CsCl),盐酸四乙胺(TEA-Cl),三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Mg-ATP,KF 均为Sigma 产品。RPMI1640培养基(GIBCO)。 细胞外液及电极液的配制：标准细胞外液(mmol/L): NaCl 150, KCl 5, MgCl2

1.1, CaCl2 2.6, HEPES 10, glucose 10。用100 mmol/L Tris-HCl调整pH 值到7.4。 标准电极液(mmol/L):KCl 65,KOH 5,KF 80,HEPES 10,EGTA 10,Mg-ATP 2。用100 mmol/L Tris调整pH 值到7.2。

玻璃微电极的制备：由玻璃电极毛胚经电极拉制器两步拉制而成, 其尖端直径为1 μm 左右的电极, 选用充灌后的阻抗为2～5 MΩ的微管电极。

人肝癌细胞系BEL-7402细胞的准备：当细胞在培养瓶中长成单层后，转入35 mm × 10 mm的培养皿中培养72 h后用于实验。

全细胞膜片钳记录：倒置显微镜下, 在微操纵器操纵下，形成高阻封接(giga-seal),其阻值＞5×109Ω，全细胞膜片钳记录形成后。用IBM-AT 兼容机运行PClamp5.5.1程序控制各种参数, 通过TL-1型A/D、D/A转换器与EPC-7型膜片钳放大器相连, 电压电流信号经滤波后及模数转换后存于硬盘。均在室温下进行。 数据处理及统计分析：全细胞膜片钳记录的实验资料采用PClamp5.5.1程序进行分析。计量资料以均数±标准差

(±s)表示, 并采用t 检验进行显著性检验，计数资料则用χ2检验。

2 结果

2.1 传代后培养时间对稳定高阻封接的影响

人肝癌细胞系BEL-7402细胞在传代后的不同培养时间对形成稳定高阻封接有明显的影响，最佳培养时间是72 h，见表1。

表1 传代后不同的培养时间对高阻封接成功率的影响

Table 1 The effect of different culture time on the success rate

of high-resistance seal Group Culture timeNumber of Number of success

(hours) submitted to cellseal (%)

12

11

70 3(25%)

2(18.2%) 43(61.4%) 1 12 2 48 3 72

Group 1 υs Group 2, χ2=0.012, P＞0.05； Group 1 υs Group 3， χ2=5.52, P＜0.05； Group 2 υs Group 3, χ2=5.56, P＜0.05.

2.2 细胞的静息膜电位

由EPC-7膜片钳放大器的电流钳制(current clamp, CC)方式，测得细胞的静息膜电位为（－22.24±2.84） mV(n=7)。

2.3 全细胞膜片钳记录

用电压钳制方式, 给细胞施以钳制电位（holding potential, HP)HP=－100 mV ，再给予阶梯去极化钳制脉冲刺激即测试电位(test potential, TP)，每阶梯升幅为10 mV，刺激持续时间为80 ms，刺激频率1 Hz，引出的跨膜电流图像如图1。此电流具有电压依赖性，其I-V 曲线呈指数曲线如图2(n=15)，并可以看出该细胞跨膜电流的翻转电位在－80～－70 mV 之间。改变钳制电位HP=－40 mV ，记录的跨膜电流图像如图3，其I-V 曲线如图4(n=6)。该细胞跨膜电流在800 ms 中电流不失活，跨膜电流具有不失活性特性。

图1 HP=－100 mV,TP=－100～190 mV, step=10 mV,episode=30,记录到的人肝癌细胞系BEL-7402细胞的跨膜电流

Figure 1 The transmembrane current of the human hepatocyte carcinoma cells of cell line BEL-7402. HP=－100 mV, TP=－100～190 mV, step=10 mV, episode=30

图2 HP=－100 mV 时，人肝癌细胞系BEL-7402细胞跨膜电流的电压-电流曲线(n=15)

Figure 2 The voltage-current curve of transmembrane current in the human hepatocyte carcinoma cells of cell line BEL-7402. HP=－100

mV(n=15)

图3 HP=－40 mV, TP=－40～200 mV, step=10 mV, episode=25，记录到的人肝癌细胞系BEL-7402细胞的跨膜电流

Figure 3 The transmembrane current of the human hepatocyte carcinoma cells of cell line BEL-7402. TP=－40～200 mV, step=10 mV, episode=25

2.4 该跨膜电流基本特性

跨膜电流的电荷载体：将电极内液中的K ＋用等摩尔的Cs +取代, 基本上记录不到跨膜电流(图5) 。

激活电流的时间常数（τ）：离子通道在200 ms内完全激活, 用Clampfit 程序对电流激活的时间过程进行拟合，发现可用单指数进行拟合。不同TP 下激活电流曲线的时间常数τ值如表2(n=5)。

图4 HP=－40 mV 时，人肝癌细胞系BEL-7402细胞跨膜电流的电压-电流曲线(n=6)

Figure 4 The voltage-current curve of transmembrane current in the human

hepatocyte carcinoma cells of cell line BEL-7402. HP,－40

mV (n=6)

图5 用150 mmol/L Cs+代替标准电极液中的150 mmol/L K+后基本记录不到跨膜电流。细胞外液仍为标准细胞外液。HP, －100 mV; TP, －100～90 mV; step,10 mV; episode, 20mV

Figure 5 When 150 mmol/L K+ of electrode solution was replaced by 150 mmol/L Cs +, almost no transmembrane current was recorded. The extracellular solution was still the standard extracellular solution. HP,

－100 mV; TP,－100～90 mV; step,10 mV; episode,20 mV

人肝癌细胞系BEL-7402细胞的K +电流的药理学特性：用加药装置将含K +通道通道阻断剂的细胞外液加到细胞周围，均能使跨膜电流峰值降低。在HP=－100 mV ，TP=－100～90 mV ，step=10 mV 条件下，20 mol/L 4-AP加药前为（1 102±295） pA ，加药后下降了（159±167） pA(n=6,P＞0.05) ，下降14.39%。20 mol/L TEA－Cl 加药前为（1 595±531） pA ，加药后下降了(1 056±394) pA(n=10,P＜0.05) ，下降了66.25%。10 mol/L CsCl加药前为（1 058±481） pA ，加药后下降了(44±337) pA(n=8,P＞0.05) ，下降了4.18%。

3 讨论

用膜片钳的全细胞记录方式研究细胞膜离子通道的先决条件是在微电极与细胞膜之间形成109Ω级的高阻封接。发现细胞传代后形成稳定高阻封接的最佳培养时间是72 h(表1) 。这可能是由于细胞传代培养时胰酶和EDTA 对细胞膜的破坏作用。此结果与利用膜片钳的全细胞记录方式研究人黑色素瘤细胞结果相似［3］。

表2 不同TP 下激活电流曲线的时间常数τ值(±s,n=5)

Table 2 Time constant(τ) of activating current curve under different test potential(±s,n=5) TP

(mV)

－20

－10τ值 (ms) 10.2±4.0 9.5±3.7

10

20

30

40

50

60

70

80

90 9.2±3.9 8.9±4.0 8.7±4.1 7.8±3.2 7.7±3.9 6.3±3.9 5.5±3.4 4.3±2.0 3.9±1.2 3.4±0.9

对非可兴奋性细胞的静息膜电位报告较少，在报告中同一组织来源的细胞其结果变化也较大。我们在全细胞膜片钳记录的CC 状态下测得人肝癌细胞系

［］BEL-7402细胞的静息膜电位为(－22.2±2.8） mV(n=7)与Smith 5用微电极测得

腹水肿瘤细胞(Ehrlich ascites tumor cell)的静息膜电位－23.2 mV 接近［5］，该细胞的静息膜电位较可兴奋性细胞的静息膜电位高，其原因可能是该细胞膜本身特性决定的。

几乎每一次都能发现相类似的跨膜电流(图1、3) ，将电极内液的K ＋用等摩尔的Cs +取代, 基本上记录不到跨膜电流(图5) ，提示该跨膜电流主要由K +携带，且该跨膜电流具有电压依赖性、I-V 曲线呈指数关系（图2、4），在800 ms 内无失活现象，具有慢失活特性。该跨膜电流的翻转电位在（－80～－70） mV

+之间，与根据Nerst 方程计算出K 的平衡电位E k =－90.77 mV 相近。跨膜电流能

被K +通道阻断剂TEA-Cl 、4-AP 、CsCl 不同程度阻断。

以上结果说明在人肝癌细胞系BEL-7402细胞记录到的跨膜电流主要电荷载体是K +，类似于神经、肌肉细胞的延迟整流性K +通道。

参考文献

1 Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrance

patches.Pflugers Arch, 1986，391:85～100

2 Wangman A, Young JA, Cook DIA. 23-PS Ca2+-activated K+ channel in MCF-7 human breast carcinoma cells:an apparent correlation of channel incidence proliferation. Pflugers Arch, 1991，417:562～570

3 Nilius B， Wohlrab W. Potassium channels and regulation of proliferation of human melanoma cells. J Physiol, 1992，445:537～548

4 Lepple-Wienhuesk A, Berweck S, Bohming M， et al. K+ channels and the intracellular calcium signal in melanoma cell proliferation.J Membr Biol, 1996，151:149～157

5 Smith TC， Robinson SC. The membrance potential of Ehrlich ascites tumor

cells:an evaluation of the null point method. J cell Physiol, 1981，106:399～466

（1997-08-20收稿)

(本文编辑：景 霞 周传敬)