最后修改---李光达-复方穿心莲片质量标准研究

复方穿心莲片质量标准研究

石秀菊 赵旭光 郭 奕

（1. 天津中医药大学，天津 300193；2. 通化金马药业集团股份有限公司，吉林 通化 134001；

3. 吉林通化吉通药业有限公司，吉林 通化 134001 ）

摘 要：目的：建立复方穿心莲片的质量标准。方法：用薄层色谱法对复方穿心莲片中的苦木药材进行定性鉴别；用高效液相色谱法（HPLC ）对制剂中的穿心莲进行穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量测定。结果：薄层色谱的斑点专属性强，重现性好；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（55:45）为流动相；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长穿心莲内酯为225 nm；脱水穿心莲内酯为254 nm。经过方法学考察，该含量测定方法具有一定的专属性、准确性、重现性和可行性，平均回收率分别为100.85%和101.55%，RSD 分别为1.62%和1.40%。结论：该标准能较好地控制产品的质量。

关键词：复方穿心莲片；薄层色谱法；高效液相色谱法；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯

0 引言

复方穿心莲片处方由穿心莲、苦木两味药材组成。其处方中：（1）穿心莲性味苦、寒，归心、肺、大肠、膀胱经。其具备清热解毒、凉血、消肿的功效，用于肠炎、痢疾、扁桃体炎、咽喉炎、肺炎、支气管炎、化脓性中耳炎、疮疖、尿路感染、外伤感染、毒蛇咬伤等疾病的治疗。现代药理研究表明，穿心莲甲、乙、丙、丁素对伤寒副伤寒菌苗所致发热兔或2，4-二硝基酚所致发热大鼠均有一定的解热作用；穿心莲黄酮类具有抗病原微生物作用；穿心莲内酯和穿心莲甲、乙、丙、丁素能明显抑制蛋白、组胺、二甲苯、醋酸所致小鼠皮肤或腹腔毛细血管通透性增高、大鼠蛋清性足肿胀、巴豆油肉芽囊及炎性渗出量；同时穿心莲还具有增强免疫功能、抗蛇毒、抗生育等作用。（2）苦木性味苦、寒、有小毒，归肺、大肠经。其具备清热、祛湿、解毒、杀虫的功效，用于痢疾、胃肠炎、胆道感染、蛔虫病、急性化脓性感染以及风热感冒、咽喉肿痛、湿疹、疮疖、毒蛇咬伤等疾病的治疗。现代药理研究表明，苦木生物碱17.5 mg/mL体外对溶血链球菌、金葡球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌及八叠球菌有抑制作用，还可抑制溶组织内阿米巴的运动，同时苦木还具有抗蛇毒及保肝、降压等作用。

因此，复方穿心莲片组方符合中医药理论，具有清热、解毒、凉血、燥湿之功效，可用于细菌性痢疾、急性肠炎及各种急性感染性疾患。为有效控制产品的质量，保证临床疗效的稳定，采用薄层色谱法对处方中的苦木药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对处方中的穿心莲进行穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量测定。 1 仪器与试剂 1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，滕州鲁南分析仪器有限公司；二极管阵列检测器，江苏汉邦科技有限公司。 1.2 试剂

穿心莲内酯对照品（批号：110797-200307，供含量测定用）、脱水穿心莲内酯对照品（批号：110854-200306，供含量测定用），中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱醇，美国Fisher 公司；其他试剂均为分析纯，北京化工厂；水为超纯水（18.2 M Ω·cm ）；0.45 μm 滤膜，安捷伦公司。 2 实验方法 2.1 定性鉴别

[1]

苦木的鉴别：取本品30片，去除包衣后研细，加乙醇30 mL，超声处理（功率300 W，频

1

2

3

率25 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取穿心莲和苦木对照药材各0.5 g，分别同法制成对照药材溶液。再取脱水穿心莲内酯对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

按照《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5 μL ，分别点于同一硅胶GF 254薄层板上，置于以甲苯-氯仿-丙酮（4:1:5）溶液为展开剂的层析缸中饱和15 min，展开，取出，晾干。当置于紫外灯（254 nm）下检视时，在供试品色谱中，在与穿心莲内酯对照品和穿心莲对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；当置于紫外灯（365 nm ）下检视，在供试品色谱（图1）中，在与苦木对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

图1 苦木薄层色谱图

1—苦木对照药材 2、3、4—供试品 5—阴性对照品

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil （TM ）C 18分析柱（250 mm ×4.6 mm ，5 μm ）；流动相：甲醇-水（55:45）；流速：1.2 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长穿心莲内酯为225 nm，脱水穿心莲内酯为254 nm。

理论板数按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于2 000。 2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取穿心莲内酯对照品1.45 mg 和脱水穿心莲内酯对照品8.30 mg ，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL 含58 μg 穿心莲内酯和332 μg 脱水穿心莲内酯的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品150片，去除包衣后研细，混匀，取16.55 g ，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加甲醇约50 mL，超声处理30 min，取出，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，续滤液浓缩定溶于25 mL量瓶，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 测定波长的选择

精密称取穿心莲内酯对照品和脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇使其溶解，于紫外可见分光光度计上，在200～400 nm波长范围内进行扫描，穿心莲内酯在225 nm波长处有最大吸收，故测定穿心莲内酯检测波长为225 nm。

[2-3]

脱水穿心莲内酯在254 nm波长处有最大吸收，故测定脱水穿心莲内酯检测波长为254 nm。 2.2.4.2 流动相的选择

根据文献资料，流动相曾选择甲醇-水（55:45）、乙腈-0.1%氨水（35:65）、乙腈-0.1%磷酸溶液（35:65）作为流动相。

结果：以甲醇-水（55:45）作为流动相，供试品分离效果最佳，故确定为该条件。 2.2.4.3 系统适用性试验的考察

依照上述方法，测得穿心莲内酯对照品、供试品复方穿心莲片的色谱图，分别如图2、图3所示，计算其理论板数：

n =5.54（t R /W h/2）2= 5.54（4.02/0.15）2=3979

式中 t R ——保留时间，min ；

W h/2——半高峰宽，min 。

该色谱条件下，供试品峰与其他峰可得到较好的分离（分离度R ＞1.5），故规定理论板数按穿心莲内酯峰计算应不低于2 000。

图2

225nm ）

图3 供试品复方穿心莲片高效液相色谱图（穿心莲内酯225nm ）图中峰值在9.744min 依照上述方法，测得脱水穿心莲内酯对照品高效液相色谱图、供试品复方穿心莲片高效液相色谱图，如图4、图5所示，计算其理论板数：

n = 5.54（t R /Wh/2）2= 5.54（11.75/0.30）2=8499

该色谱条件下，供试品峰与其他峰可得到较好的分离（分离度R ＞1.5），故规定理论板数按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于2 000。

图4 脱水穿心莲内酯高效液相色谱图（254nm ）图中峰值在

26.786min

图5 供试品复方穿心莲片高效液相色谱图（脱水穿心莲内酯254nm ）图中峰值在26.775min 2.2.4.4 阴性对照品溶液的制备及测定

为进一步考察实验设计及含量测定方法的可行性和专属性，取不含穿心莲的处方，按制备工艺制成缺穿心莲的阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液，精密吸取阴性对照品溶液10 μL 注入液相色谱仪，按上述方法测定。

结果表明：穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯阴性对照品溶液及其试剂的色谱图在穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯相应的保留时间附近无干扰峰，其相应色谱图如图6、图7、图8、图9所示，证明本法具有良好的专属性。

图6 阴性对照品高效液相色谱图（穿心莲内酯225 nm）

图7 试剂高效液相色谱图（穿心莲内酯225 nm）

图8 阴性对照品高效液相色谱图（脱水穿心莲内酯254 nm）

图9 试剂高效液相色谱图（脱水穿心莲内酯254 nm）

2.2.4.5 线性关系考察

分别精密吸取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液2 μL 、5 μL 、10 μL 、15 μL 和20 μL ，分别注入液相色谱仪，以进样量（μg ）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯线性关系考察如表1所示，绘制标准曲线分别如图10、图11所示。

穿心莲内酯回归方程：Y ＝1 945 621.51X ＋2 309.24，R ＝0.999 9，线性范围为0.116～1.160μg 。

脱水穿心莲内酯回归方程：Y ＝1 584 878.61X －5 719.66，R ＝0.999 9，线性范围为0.664～6.640 μg 。

表1 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯线性关系考察

穿心莲内酯进样

量/μg 0.116 0.290 0.580 0.870 1.160

穿心莲内酯峰 面积积分值 232 880 560 385 1 133 031 1 691 378 2 261 867

脱水穿心莲内酯 进样量/μg 0.664 1.660 3.320 4.980 6.640

脱水穿心莲内酯峰面积

积分值 1 067 320 2 607 800 5 252 480 7 871 858 10 533 288

图10 穿心莲内酯标准曲线

图11 脱水穿心莲内酯标准曲线

2.2.4.6 精密度试验

精密吸取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液各10 μL ，分别注入液相色谱仪，连续进样5次，依法测定，记录峰面积积分值，计算考察精密度，结果如表2所示。

表2 精密度试验

序号 1

穿心莲内酯样品峰面积 脱水穿心莲内酯样品峰面积 1 130 329 5 246 874

2 3 4 5

1 132 597 5 255 279 1 136 539 5 307 863 1 142 415 5 328 724 1 124 909 5 287 126 1 133 357 5 285 173 0.58 0.65

x

RSD/%

精密度考察结果：穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液连续测定结果的RSD 分别为0.58%、0.65%，表明仪器的精密度良好。 2.2.4.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液各10 μL ，每隔一定时间分别注入液相色谱仪，依法测定，以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积积分值为指标，测定其稳定性，结果如表3所示。

表3 稳定性实验

时间/h 0 4 8 16 24

穿心莲内酯样品峰面积 脱水穿心莲内酯样品峰面积

1 342 249 5 886 658 1 363 254 5 945 209 1 340 966 5 949 129 1 302 076 5 941 765 1 367 830 5 857 636 1 343 275 5 916 079 1.94 0.70

x

RSD/%

稳定性考察结果：供试品溶液在24 h内测定结果的RSD 分别为1.94%、0.70%，表明穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的稳定性良好。 2.2.4.8 重现性试验

精密称取同一批样品（批号：20160401）共5 份，按供试品溶液项下制备，依法独立测定，计算样品含量以考察本法的重现性，结果如表4所示。

表4 重现性实验

序号 1 2 3 4 5

穿心莲内酯含量/（mg/g）

0.080 24 0.080 65 0.080 21 0.080 55 0.080 31 0.080 34 0.24

脱水穿心莲内酯/（mg/g）

0.558 3 0.559 5 0.562 5 0.563 0 0.553 8 0.559 4 0.66

x RSD/%

以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为含量测定指标，考察本法的重现性。结果：RSD 分别为0.24%和0.66%，表明该方法重现性良好。 2.2.4.9 加样回收率实验

精密称取同法测定的已知含量样品（穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯分别为0.081 23 mg/g、0.558 3 mg/g，批号：20160401）共5份，分别精密加入对照品适量，依法测定，计算回收率，

结果如表5所示。

表5 加样回收率实验

成分

样品量/mg 8 302.2 8 307.1 8 302.6

穿心莲 内酯

8 307.5 8 309.2 8 302.2 8 307.1 8 302.6

脱水穿心莲

内酯

8 307.5 8 309.2

样品含量/mg 加入量/mg 测得值/mg 0.674 4 0.674 8 0.674 4 0.674 8 0.675 0 4.635 1 4.637 9 4.635 3 4.638 1 4.639 0

0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 4.54 4.54 4.54 4.54 4.54

1.421 0 1.400 3 1.392 1 1.394 6 1.396 1 9.159 0 9.222 1 9.232 6 9.318 9 9.304 4

回收率/% 平均值/% 103.69 100.77 99.69 99.97 100.15 99.65 100.97 101.26 103.10 102.76

100.85 101.55

RSD/% 1.62 1.40

结果表明：RSD 分别为1.62%和1.40%，平均回收率分别为 100.85%和101.55%，表明本法准确性较好，方法可行。

2.2.4.10 10批样品含量测定结果

取10批样品，依法制备供试品溶液，每批2份，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL ，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算10批样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯总含量，结果如表6所示。

表6 10批样品的含量测定结果

0.083 51 mg/片。

2.2.4.11 3批穿心莲药材测定结果

依照《中国药典》2015年一部穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯项下测定3批穿心莲药材，结果如表7所示。

表7 3批穿心莲药材的含量测定结果 来源 穿心莲内酯/（mg/g） 平均含量/（mg/g） 脱水穿心莲内酯/

（mg/g） 平均含量/ 总含量/ （mg/g） %

结果：3批药材测定结果均符合“不少于0.80%”的规定。 2.2.4.12 样品的含量测定限度的确定

通过对10批样品和3批穿心莲药材的含量测定表明，穿心莲药材及样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量有一定差异，如图12、图13所示，考虑到药材不同产地的质量差异及生产过程中波动，暂规定本品每片含穿心莲以穿心莲内酯（C 20H 30O 5）和脱水穿心莲内酯（C 20H 28O 4）计，总量不得少于0.060 mg。

图12 穿心莲药材高效液相色谱图（穿心莲内酯225 nm）图中峰值在9.257min

图13 穿心莲药材高效液相色谱图（脱水穿心莲内酯254 nm）图中峰值在26.711min 3 结语

3.1 提取纯化方法考察

提取溶剂和方法的考察：穿心莲内酯易溶于丙酮、甲醇、乙醇，微溶于氯仿、乙醚，难溶于水、石油醚。脱水穿心莲内酯易溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于氯仿，几乎不溶于水。根据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的化学性质，选择甲醇、乙醇、丙酮作为提取溶剂，提取方法选择超声提取法。由于甲醇提取所测得的含量最高，故选择甲醇作为提取溶剂。

提取时间的考察：取本品，除去薄膜衣，研细，取3份，每份1.0 g，分别加甲醇25 mL，分别超声提取20 min、30 min 及40 min ，通过测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量跟踪检查，比较了超声提取法所用时间，试验结果表明超声提取30 min 与40 min 的提取效率基本接近，均高于20 min 提取率，故提取方法采用超声提取法，确定提取时间为30 min 。 3.2 薄层鉴别研究

根据《药品注册管理办法》及有关规定，为了全面提高复方穿心莲片的质量标准，对处方中

的苦木进行了鉴别研究。研究结果表明，苦木的薄层色谱鉴别条件具有专属性，且灵敏度高，重现性良好，能够起到鉴别真伪的作用，故列入标准的鉴别项中。 3.3 含量测定研究

制剂质量标准中的含量测定项，经过方法学考察，结果表明上述含量测定方法具有一定的专属性、准确性、重现性和可行性，可有效控制产品的内在质量。通过对10批样品含量测定的实际结果并基于不同产地药材含量的波动性，暂规定本品每片含穿心莲以穿心莲内酯（C 20H 30O 5）和脱水穿心莲内酯（C 20H 28O 4）计，总量不得少于0.060 mg。

[参考文献]

[1] 吕武清，龙新华主编. 中成药中的药材薄层色谱鉴别[M].北京：人民卫生出版社，1997. [2] 徐韧柳. 复方苦木消炎片薄层鉴别与脱水穿心莲内酯含量测定研究[J].中成药，2004，26

（12）：1003～1006. [3] 吴振华，蔡伟毅. 高效液相色谱法测定穿心莲内酯的含量[J].中国药物与临床，2006，6（5）： 363-364.

收稿日期：2016-09-14

作者简介：石秀菊（1982—），女，吉林通化人，工程师，研究方向：固体制剂、口服液、注射剂的研发。

赵旭光（1983—），男，吉林通化人，工程师，研究方向：中药制剂的研发。 郭奕（1973—），女，吉林通化人，工程师，研究方向：中药制剂的研发。

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