茶叶中游离氨基酸分析方法的研究进展

安徽农业科学．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡＳｈ．￥ｃｉ．２０１０，３８（１７）：９１８６—９１８７，９２１０

责任编辑章练红责任校对卢瑶

茶叶中游离氨基酸分析方法的研究进展

井然１’。，冯雷２，陈丽梅ｈ

（１．昆明理工大学生命科学与技术学院生物工程技术研究中心，云南昆明，６５０２２４；２．云南省产品质量监督检验研究院，云南昆明６５０２２３）

摘要氨基酸是构成生命体的基本物质之一，也是茶叶的主要化学成分之一，是形成茶叶滋味的重要组成部分，因此对茶叶中游离氨基酸的分析检测是十分必要的：综述了目前用于茶叶中游离氨基酸分析检测的诸多方法，并对这些方法的优缺点进行了分析，同时对未来分析方法的发展提出了展望。

关键词游离氨基酸；茶叶；分析检测方法中图分类号￥５７２文献标识码Ａ文章编号０５１７—６６１ｌ（２０１０）１７—０９１８６—０２ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＡｎａｌｙｍｉｇＦｒｅｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＣｏｎｔｅｎｔｉｎＴｅａ

ＪＩＮＧＲａｎｅｔａｌ（ＢｉｏｌｏｇｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｃｈｏｏｌ，ＫｕｎｍｉｎｇＵ＿西ＶｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ６５０２２４）ＡｂｓｔｒａｃｔＡｍｉｎｏａｃｉｄｉＳｏｎｅｏｆｔｈｅｂａｓｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＩｔｉＳａ１８０ｏｎｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｅａａｎｄｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｏｍｐｏ－ｎｅｎｔｏｆｔｅａｔａｓｔｅ．１１１ｕｓ．ａｎａｌｙｚｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｆｒｅｅａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｅａｉｓｖｅｒｙｎｅｃｅｓｓａｒｙ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ

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ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｆｕｔｕｒｅＷａｓｆｏｒｅｃａｓｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ

Ｆｒｅｅａｍｉｎｏａｃｉｄ；Ｔｅａ；Ａｎａｌｙｚｉｎｇｍｅｔｈｏｄ

在茶叶中，氨基酸是其主要的化学成分之一。目前已发现在茶叶中的氨基酸有２６种’１Ｊ，如茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸等，其中茶氨酸占氨基酸总量的５０％以上，是茶叶的特征性氨基酸。“。茶叶中氨基酸的组成、含量、其降解产物和转化产物以及这些组分间的含量变化将直接影响到茶叶的香气和滋味，对茶叶的品质具有重要作用。如茶氨酸具有类似味精的鲜爽和焦糖香气，对茶汤的滋味和香气均有良好的作用川；谷氨酸和天门冬氨酸具有鲜昧；精氨酸具有鲜甜滋味。因此，茶叶中氨基酸的分析研究对于茶叶的品质鉴定等具有十分重要的意义。近年来，许多学者致力于氨基酸分析检测技术的研究，对氨基酸的分析测定方法进行了改进，得到了一系列可用于茶叶中氨基酸分析检测的方法，为此，笔者就这方面的研究进展进行综述。ｌ茶叶游离氨基酸分析方法

１．１茚三酮比色法该方法主要是用来对游离氨基酸总量进行测定，是目前测定氨基酸总量的常用方法，也是国家标准ＧＢ／Ｔ８３１４—２００２中所采用的方法。此方法的主要原理是，ｄ．氨基酸在ｐＨ值为８．０的条件下与茚三酮加热反应，可以形成紫色络合物，使用分光光度计在５７０ｒｉｍ处测定其吸光度，从而推算氨基酸的总量卜ｏ。此方法的优点在于可以快速、简便地测定氨基酸的总量，但其同样存在明显的缺点，即此法所测定的值可信度不高。其主要原因在于：①使用分光光度计所测出的值精确度低，重现性不好，出现误差的可能性很高；②制作标准曲线时所使用的茶氨酸虽然是茶叶中的特殊氨基酸，且其含量一般占到氨基酸总量的５０％以上怕１，但由它所计算出来的氨基酸含量，也只能代表茶氨酸的含量，而不能代表氨基酸的总量；③制作标准曲线时的操作步骤与样品测定时的不一致旧ｊ。周围兰等通过改进标准曲线

基金项目

普洱茶标准体系构建及品质鉴定技术研究项目（２００７ＢＡＤ一５８８０６）；教育部留学回国人员科研启动基金项目（２００５—

５５）。

的制作方法．使得测定结果的精确度和重现性得到提高怕】。１．２氨基酸自动分析仪法该方法是指高效阳离子交换色谱（ＨＰＣＥＣ）一柱后茚三酮衍生化法。１９５８年，由Ｓｐａｃｋｍａｎ等首先提出此法用于分析蛋白质中的氨基酸，并实现了氨基酸分析的自动化。“。随后，在２０世纪６０年代初，商品化的氨基酸自动分析仪便宣告问世了，掀开了氨基酸分析新的一页。该方法的原理是，氨基酸在酸性条件下形成阳离子，在阳离子交换柱中进行保留从而达到分离的目的，分离后的氨基酸用茚三酮衍牛化为紫色衍生物，最终通过紫外检测器对紫色衍生物进行检测。此法具有样品制备的Ｔ作最较少、离子交换分离对本底的耐受性较好，同时参考资料较多等特点，因此在很长一段时间内该方法成为人们用来分析氨基酸的主要方法，它但在运用此法的过程中，人们逐渐发现它也

存在很多问题：①硬件配置复杂，用途专一，灵活性差；②购

买及维护成本高；③分析时间很长；④破坏氨基酸的固有结构。因此，人们又开始去开发一些其他的方法来用以分析氨基酸。

１．３柱前衍生高效液相色谱法

随着高效液相色谱在分

析领域罩的快速发展，以及其所具有的众多优势，人们开始考虑用它来代替传统的氨基酸自动分析仪法进行氨基酸的分析检测‘８ｏ。柱前衍生高效液相色谱法顾名思义就是先用衍牛试剂将氨基酸转化为可用于液相色谱分离并能被灵敏检测到的衍生物，冉通过高效液相色谱进行检测。此方法有如下优点：①提高复杂本底样品分析的灵敏度（ＵＶ或荧光检测）；②分离条件较易改进，以利于特殊氨基酸如含磷氨基酸或氨基糖等的分析；③通用性强，可用于分析小肽或其他非

氨基酸样品；④分析速度较快，对氨基酸一般没有破坏作用。

该方法的关键就是衍生试剂的选择一１，而每一次新型衍生试剂的诞生都推动了此方法的发展。目前常用的衍生试剂主要有邻苯二甲醛（ＯＰＡ）¨…、异硫氰酸苯酯（ＰＩＴＣ）¨“、氯甲酸芴甲酯（ＦＭＯＣ．Ｃ１）Ｈ“、丹酰氯（Ｄａｎｓｙｉ—ＣＩ）¨…、乙内酰苯硫脲（ＰｒＨ）、６一氨基喹啉．Ｎ一琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（ＡＱＣ）【１４。等。它们的一些特点由表ｌ所示。

作者简介收稿日期

井然（１９８５一），男，安徽淮南人。硕士研究生，研究方向：植物基因工程。ｔ通讯作者。

２０ｌＯ．０３．２３

万方数据

３８卷１７期井然等茶叶中游离氨基酸分析方法的研究进展９１８７

表１

Ｔａｂｌｅ

１

Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ

高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂

ｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒ

ａＩＩａＩｙｚｍｇａｍｉｎｏａｃｉｄｂｙ

ＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ

丹酰氯（Ｄａｎｓｙｌ—ｃ１）紫外、荧光低毫中邻苯二甲醛（ＯＰＡ）荧光低异硫氰酸苯酯（ＰＩＴＣ）紫外低氯叶Ｉ酸芴甲酯（ＦＭＯＣ—ＣＩ）荧光低

乙内酰苯硫脲（ＦｒｒＨ）紫外

低至中６・氨基喹啉一Ｎ一琥珀酰亚紫外、荧光高

胺基氨基甲酸酯（ＡＱＣ）

１９９３年，Ｗａｔｅｒｓ公司开发了一套专门用于氨基酸分析的方法，名为ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法。此法具有以下特点：①操作简单；②灵敏度极高，荧光一检测限为５０～３００ｆｍｏｌ、紫外吸收一

检测限为Ｏ．１０～Ｏ．３０ｐｍｏｌ；③定量结果准确性很高；④精确度高，除氨基酸衍生物外无其他干扰杂质生成，衍生产物极为稳定，室温下可保存ｌ周。朱旗等人首次把此法应用于茶叶氨基酸的测定。从测定的图谱看，该方法能够较好地分离茶叶氨基酸组分，色谱图形较好一“。

尽管高效液相色谱法是目前使用最为广泛的分析氨基

酸的．方法，但是它也存在如下不足之处：①某些方法不能衍

生所有氨基酸（如ＯＰＡ）；②某些方法对氨基酸产生非单一衍生产物；③衍生反应需特定的基质条件．衍生效率取决于本

底；④对样品制备需要较多的投入；⑤有时过量的试剂会影

响分离；⑥某些技术对仪器及操作人员要求较苛刻。

１．４气相色谱法使用气相色谱法检测氨基酸也要首先对氨基酸进行衍生化，使之成为易于气化的衍生物。常用的衍生试剂有三氟乙酰（ＴＦＡ）、五氟丙酰（ＰＦＰ）、正丙醇、七氟丁酰（ＨＦＢ）和异丙醇等。该方法的优点是分离时间短、柱效高及易与质谱联用，缺点是衍生反应干扰多、专一性差。目前此方法在氨基酸分析检测中的应用并不十分广泛。１．５毛细管电泳法

毛细管电泳主要有两种模式：毛细管

区域电泳（ＣＺＥ）和胶柬电动毛细管色谱（ＭＥＫＣ）。ＭＥＫＣ的分离度要好于ＣＺＥ。此方法主要用于氨基酸的手性分离，具有分离效率高、灵敏度高、无须梯度洗脱、分析速度快和溶剂消耗少等优点。１９９７年，ＨｉｄｅｋｉＨｏｒｉｅ等曾报道，采用毛细管区带电泳可同时测定５种儿茶素、咖啡因、茶氨酸和抗坏血酸¨…。但由于其重现性差，且在实验室中的推广应用程度不及高效液相色谱法，因此限制了其在氨基酸分析检测领域中的使用。

１．６阴离子交换色谱一积分脉冲安培检测法随着色谱技术的不断发展以及新型检测器的不断涌现，氨基酸分析检测技术也有了新的突破。阴离子交换色谱一积分脉冲安培检测法是一种新的氨基酸分析检测方法。此法不需要进行衍生化，可直接对氨基酸进行分离测定。它的原理就是利用氨基酸分子中的羧基在强碱环境中会形成阴离子，从而在阴离子交换树脂上实现保留达到分离的目的，同时，氨基在强碱环境中通过施加一定的电位，能够在电极上被氧化从而被安培检测器所检测到。Ｃｌａｒｋｅ等采用高效阴离子交换柱成功地实现了氨基酸的高效阴离子交换色谱分离和积分脉冲安位蛤铜Ⅱ扯崆ｌ№青壮府田千碍白衙★衄声物锌析［＂ｊ．伯ｌ咖

万方数据

困难

分离衍生困难

简单快速

只能用于一级氨，稳定性差多步窄温反应反应步骤多

室温反应，要萃取

需要液－液萃取除去过量试剂困难

分离衍生困难加热，单步反应

分离较慢

法由于对仪器以及实验人员水平要求较高，冈此目前未得到广泛的应用。２小结

从茚三酮比色法到氨基酸自动分析仪法，再到柱前衍生高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法以及阴离子交换色谱一积分脉冲安培检测法，氨基酸的分析检测方法经历了一次又一次的发展和创新，不断丰富人们对氨基酸分析检测的手段。随着质谱技术的成熟与推广，未来的氨基酸分析方法中可能会更多的使用到液质联用、气质联用以及多级质谱等。对于茶叶而肓，今后的茶叶氨基酸分析应该更加注重对样品前处理方法的研究，尤其是对一些化学成分较特殊的茶，如普洱茶、黑茶等，要尽可能地消除茶叶中的其他成分对氨基酸分析的干扰。最好是能制定一些标准化的分析检测方法，使得氨基酸的分析检测工作更加科学和规范，从而推动茶叶检测工作的发展。参考文献

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（下转第９２１０页）

９２１０安徽农业科学２０１０年

表２

ｋ（３．）正交试验结果

Ｉ：１０（Ｗ／Ｖ），提取时间为１２ｍｉｎ，在此条件下桑叶总黄酮含

Ｔａｂｌｅ２

Ｒｅ砌ｂ

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Ｌ．（３‘）ｏｒｍｏｇｏｎａｌ

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量可达３．ｃｒ７％。

髅号餐泌昭。。黛蒸衷４不同提取方法对桑叶总黄酮提取率的影响

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（２）超声一微波协同提取桑叶中黄酮类化合物比乙醇回流法和超声波法提取时间短且提取效率增倍，该法具有简单、快速、高效，且无污染的特点，这对桑叶的开发利用具有重要的意义。参考文献

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ｃＩＩｌａｌｉ．－

ｆｉｖｅｔｙｉｍｐ０栅ｔ［１９】周缝，成浩，王丽鸳．基于定义变量的ＰＬＳ法鉴定新茶和陈茶的研究

ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｇｒｅｅｎｔｅａｉｎｆｍｉｏｍｕｓｉｆｌｇｃａ“Ｕａｆｙｄｅｃｔｒｏ－

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ＡＰ，ＪＡＮＤＩＫＰ，ＲＯＣＫＬＩＮＲＤ。ｅＩａ１．Ａｎｉｎｔｗ毗ｅｄａｍｐｅｎｍ》

［∞］王秀萍，朱海燕，陈常颂福建茶树良种的粗茶多糖提取试验研究

ｍｌ驴玛伽帆ａｎｉｏｎ一懿ｃＩ瑚萨ｃＩｌｌｏｍ砒哩呐［Ｊ］．Ａｎａｌ

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ｔｈｅｄｉｒｅｃｔ．ｓｅｍｉｆｉｖｅｄｅｔｅｅｔｉｏｎ０ｆａｍｉｎｏ∞ｉｄｓａｎｄａｍｉｎｏ

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ｅｈｅｍ，１９９９，

万方数据

试验号

塑！：

ｌ２３

２．６对比分析将超声一微波法提取的总黄酮得率与乙醇波法与乙醇回流法相比，提取时间由１．５取黄酮类化合物的量却增加了４．２倍；与超声波法相比，提取时间由４５和超声波法。３结论与讨论

为４００ｈ＋唯一．—－＋呻＿卜呻件・＋－＋—＋—＋・＋呻—＋－■—＿卜斗呻・＋－＋・＋－＋・＋・＋—＋－＋＿＋斗・＋—●叫斗呻・＋－＋一＋—－＋ｒ・＋—＋＿＋一・・．＿・＋－■—＿叶—＿卜咐——－■—＿＋—‘●一

［１７］ＱＡＲｌ（Ｅ