老年结直肠癌患者的肠道菌群检测结果分析

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现代消化及介入诊疗2012年第17卷第4期Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4

·短篇论著·

老年结直肠癌患者的肠道菌群检测结果分析

王新颖1

王中秋1

徐

萍1

李丙生1

江美玲1

许岸高1,2

【摘要】目的探讨老年结直肠癌患者的肠道菌群变化。方法选取2008年1月至2011年6月老年结直肠癌患者粪便标本50例及正常对照标本50例，运用传统梯度稀释法进行平板培养及提取粪便DNA 后应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 反应测定3种需氧菌和4种厌氧菌的数量以进行菌群分析。结果患者组粪便中需氧菌与厌氧菌菌群数与正常对照组比较均有明显改变。需氧菌中患者组金黄色葡萄球菌明显增加（P 0.05）。平板培养法与定量PCR 法结果一致，PCR 法较平板培养法更敏感。结论老年结直肠癌患者存在肠道菌群紊乱，其粪便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量较正常对照明显减少，金黄色葡萄球菌和拟杆菌数量明显增多，随年龄增加发展与肠菌群紊乱程度更严重，提示老年结直肠癌的发生、道菌群有一定关系，针对性的补充益生菌可能是缓解病情的有效方法。

【关键词】老年；结直肠癌；肠道菌群；平板培养；实时荧光定量PCR

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病率居我国恶性肿瘤第三位，随着生活水平的提高、生活习惯的改变，其发病率逐年增加[1]。老年人是结直肠癌的高发人群，随着年龄增长，结直肠癌发病的危险性增加。在发达国家，90%以上病例在50岁以上，英国发病高峰年龄为70岁，美5%～10%为80岁[2]，国发病高峰为75岁，40岁以下发病少于6%[3]。我国结直肠癌发病同样具有老年化趋向。上海中位发病年龄为61岁，广直肠癌为65岁[4]。目前结直州结肠癌中位发病年龄为66岁，

肠癌的病因尚未完全清楚，感染是否是结直肠癌的促发因素，目前尚未被证实，已有研究提出结肠细菌产生的过氧化物可促发癌症[5]。但老年结直肠癌发病与肠道菌群紊乱是否存在相关性目前尚无文献报道。因此，研究老年结直肠癌患者肠道菌群状况，可以为该病在老年人群中的发病机理提出佐证，并为制定治疗和预后评估方案提供参考。本研究选取南方医院2008～2011年确诊的老年结直肠癌患者50例作

作者单位：1510515南方医科大学南方医院消化内科；

2516003惠州市医学研究所

通讯作者：许岸高，E-mail ：[email protected]基金项目：惠州市科技计划项目（NO ：）2010Y061

为研究对象，旨在探讨其肠道菌群的变化情况。

对象与方法

一、研究对象

经我院结肠镜下取材行病理检查诊断证实为结肠癌的按中华老年医学学会建议，取60岁50例老年结直肠癌患者，

以上患者，其中男36例，女14例，平均年龄67岁（60～82岁），划分为：确诊时均为晚60～69岁、70～79岁、80岁以上；期，于治疗前取样，取样前4周内均未应用抗生素或微生态制剂。相应时间段内取正常对照50例，其中男32例，女18例，平均年龄61.5岁（60～81岁），所有正常对照者均无消化道慢性疾病史，常规体检及粪便常规检查均未见异常，留取粪便标本前4周内均未应用抗生素或微生态制剂。2组的年龄及性别构成差异均无统计学意义（P >0.05）。

二、研究方法

采用平板培养法及SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 法检测粪便菌群中3种需氧菌群（肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌）和4种厌氧菌群（拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、小梭菌）的变化。

1. 平板培养法

采用日本光岗知足方法，取新鲜粪便标本0.5g 置于含有4.5ml 稀释液（加有4～5粒玻璃珠）小瓶中，置旋涡混合器（300r/min）震荡1min ；另取7只无菌青霉素小瓶，每瓶加稀释液1.8ml 。从首只小瓶中取0.2ml 混悬液至第二个小瓶中震荡混匀，依次稀释，按稀释度分别为10-2、…10-8。稀10-3、释后的标本接种于培养基，每个平板3个稀释度。需氧菌置厌氧菌置37℃厌氧培养箱7237℃温箱24h 后后观察结果，

再转换为cfu/g粪便。菌落计数经涂片、革h 后观察结果计数，

兰染色、生化鉴定，必要时使用气相色谱检测细菌代谢产物，确认为该菌。

2. SYBR Green I 实时荧光定量PCR 法）反应引物的设计与合成（1

肠杆菌参照Anderson B 等报道[6]，肠球菌、金黄色葡萄球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、小梭菌参照Matsuda K 等报道[7]，拟杆菌根据其cfxA 基因系列设计引物。8对引物用Blast 进行在线核实其特异性后，由上海英骏生物技术有限公司合成。引物系列见表1。

（2）粪便DNA 提取及PCR 反应

取样后称取中段大便，每份300mg ，按粪便细菌基因组（购自北京天根生化科技有限公司）说明提DNA 提取试剂盒

取粪便细菌DNA ，提取的DNA 分别进行7-20℃保存备用。

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种细菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR 反应，反应体系：上、下游引物各1μl 、模板DNA 2μl 、Real Master Mix ：9μl ，加石蜡油8μl ，反应体积为20μl 。反应条件:DEPC 水7μl 、

肠杆菌59℃，肠球菌、金95℃变性20s ；95℃预变性2min ；

黄色葡萄球菌60℃，拟杆菌57℃，双歧杆菌57℃，乳酸杆菌小梭菌59℃退火30s ，循环40次；58℃，68℃延伸30s ，74每次实验同时设标准品校正和阴性对照，反应℃后延伸30s 。

完毕后根据溶解曲线分析PCR 产物的特异性，并由Light 结果以细菌拷贝数的常用对数/Cycler PCR 仪分析定量结果。g 粪便表示。

（3）标准曲线的制作

取粪便基因组DNA 用肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌和小梭菌引物进行特异性扩增，将出现目的条带的扩增产物按DNA 产物纯化试剂盒（购自北京艾德莱生物科技有限公司）说明进行纯化，纯化产物用核酸蛋白检测仪Biophotmeter 测定OD 值及浓度，换算为各标准品1μl 的拷贝数（肠杆菌5.84×1014、肠球菌2.57×金黄色葡萄球菌3.55×1014、拟杆菌3.95×1014、双歧杆1014、

菌3.55×1014、乳酸杆菌4.57×1014、小梭菌2.02×1014）用于制作标准曲线。将各纯化产物10倍稀释后作为标准品进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 反应。根据读取的荧光数据，由系统软件自动分析循环阈值（Cycle thresho ld, Ct ），并生成标准曲线。

三、统计学分析

结果以±s 表示，应用SPSS13.0软件进行数据分析，采以P

结

果

一、平板培养法菌落计数结果

患者组粪便中需氧菌与厌氧菌菌群数与正常对照组比较均有明显改变（P

小梭菌数量无明显差别（P >0.05），见表2。

二、细菌PCR 定量检测结果

表1细菌的PCR 扩增引物系列

细菌名称

靶基因

扩增片段长度（bp ）

引物序列（5’）-3’

肠杆菌肠球菌金黄色葡萄球菌拟杆菌双歧杆菌乳酸杆菌小梭菌

16S rRNA ddl ddl cfxA cpn6016S rRNA rrnA-16S

[***********]60

F:5’-CTC GCT GGC ATT TGC GTA G-3’R:5’-ATC TTT TGC CGT CCG TTT TGC-3’F:5’-TTG GCA TTC CAC AAG TAC CA-3’R:5’-AAT TGC TCG GGC ATC ATA AC-3’F:5’-TCG GAC GAC TTT GCC TCC CG-3’R:5’-TCG CAC CGG CTC AAT CCG C-3’

F:5’-TGA CAG TGA GAG ATT TGC TGC TGC GTT-3’R:5’-TCA GCC GAC ATT TCC TCT TCC GT-3’F:5’-TAC TTC GTC ACC AAC GCT GA-3’R:5’-CCA CGG ATG TTG TTC AGG AT-3’F:5’-CAC CTT CCT CCG GTT TGT CA-3’R:5’-CGA GCG CAA CCC TTA TTA TCA-3’F:5’-TGA AAG ATG GCA TCA TTC AAC-3’R:5’-GGT ACC GTC ATT ATC TTC CCC AAA-3’

表2粪便标本平板培养结果（logN ）±s

菌属

需氧菌肠杆菌肠球菌葡萄球菌厌氧菌拟杆菌双歧杆菌乳酸杆菌小梭菌总需氧菌总厌氧菌

9.00±2.13**5.20±0.534.01±0.19**6.51±1.218.02±0.879.76±1.34

6.70±1.356.50±1.966.38±1.476.90±0.907.10±2.0510.06±2.97

9.03±1.72**3.09±0.70*2.98±0.40*7.49±1.738.19±1.207.83±0.90

7.40±1.635.10±0.304.19±0.707.04±0.637.67±0.369.44±0.70

10.01±1.73**2.28±0.33*1.03±0.51**8.13±1.459.89±1.115.25±0.87

8.31±1.614.86±0.303.09±0.627.67±0.478.16±0.297.41±0.99

8.16±2.117.31±1.208.23±0.80*

7.98±0.197.10±0.907.03±0.40

8.96±1.109.39±2.148.77±0.26

8.69±0.509.20±1.327.62±0.35

9.87±1.089.04±0.7110.24±1.22*

10.02±2.018.30±0.507.98±0.48

60~69岁

患者

正常对照

患者

70~79岁

正常对照

患者

80岁以上

正常对照

注：与相应年龄段正常对照组比较，*P

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现代消化及介入诊疗2012年第17卷第4期Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4

表3粪便标本细菌定量PCR 检测结果（logN ）±s

菌属肠杆菌肠球菌葡萄球菌拟杆菌双歧杆菌乳酸杆菌小梭菌

60～69岁

患者4.39±0.304.97±0.874.09±0.43*9.31±1.30*4.09±0.38**4.10±0.235.60±0.17

正常对照5.35±1.214.95±0.242.38±0.197.98±0.537.35±0.835.31±0.875.30±0.29

患者7.21±1.39**5.99±1.415.31±0.39**10.13±0.404.32±0.63**1.38±0.30**4.06±0.70

70～79岁

正常对照5.89±0.956.13±0.983.11±0.798.42±1.356.01±0.904.38±1.424.93±1.01

患者8.33±0.74**6.01±1.125.55±0.47**11.33±0.99**3.21±0.77**1.23±0.80**4.89±0.12

80岁以上

正常对照6.01±0.455.98±1.203.81±0.508.83±1.105.59±0.734.02±0.535.15±0.67

注：与相应年龄段正常对照组比较，*P 0.05）。见表3。

讨

论

省力、准菌属等难培养的肠道细菌的定量分析，具有更省时、确及高灵敏度的特点，结果显示老年结直肠癌患者与正常对照者间细菌数量的差异有统计学意义（P

参考文献

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7Matsuda K, Tsuji H, Asahara T. Establishment of an analytical sys －

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12Stanghellini V.Gut microbiota and related diseases:clinical features.

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结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤，其发病率随着我国人口老龄化有增高趋势[8]。肠道中细菌的组成、数量及活性在维持人体健康中起重要作用。正常情况下肠道内含有大量细

[9]

需氧菌仅占1%，主要成员为双歧杆菌，其中厌氧菌占99%，菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、消化球菌、真杆菌、韦荣氏球菌、链球菌及酵母菌等，被称为正常菌肠道菌群与宿主处于相对平衡状态，参与机群。生理情况下，

体对食物消化和吸收，能够增强机体的免疫力，对机体起到保护作用[10]；如果正常菌群失调，可引起多种疾病发生，可能与衰老和肿瘤的发生有关。但肠道感染或肠道微生态失调是否是结直肠癌的促发因素，目前尚未被证实，但已有研究提出结肠细菌产生的过氧化物可促发癌症[11,12]。同时有研究显示：结直肠癌患者肠道菌群出现微生态失调，可能与其发生、发展有关，主要表现为结直癌患者粪便中厌氧菌与需氧菌的比值下降，通常以双歧杆菌/大肠杆菌（B/E）的比值作为评估指标。双歧杆菌的减少会导致机体抗肿瘤免疫力下降，使肿瘤细胞逃离机体免疫监控的机会增大。Tannock 等研究

[13]

[14]

也证明类杆菌、梭杆菌及梭状芽胞杆菌在肠道内增多有致癌作用，这些细菌通过产生致癌物质、辅致癌物质或前致癌物对于了质而导致癌症的发生。因此对肠道细菌变化的研究，解细菌在结直肠癌发病中的作用，寻找结直肠癌最佳治疗方法有重要意义。

基于以上考虑，本研究主要选取了肠道菌群中3种需氧菌群（肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌）和4种厌氧菌群（拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、小梭菌），检测老年结直肠癌患者的肠道菌群状况，结果显示老年结直肠癌患者粪便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量明显减少，以双歧杆菌属减少为甚；金黄色葡萄球菌、拟杆菌数量明显增加，且随年龄增加，变化更加明显，高龄老人减少最严重，提示老年结直肠癌患者肠道菌群出现微生态失调，且与年龄具有相关性。我们同时利用传统细菌培养法和分子生物学技术16SrRNA 法定量检测患者粪便菌群，二者结果一致。后者能够实现对双歧杆菌属、乳酸杆

现代消化及介入诊疗2012年第17卷第4期Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4

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13Appleyard CB, Cruz ML, Isidro AA, et al. Pretreatment with the

probiotic VSL#3delays transition from inflammation to dysplasia in a rat model of colitis -associated cancer.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011,301:G1004-1013.

14Bibiloni R, Simon MA, Albright C, et al. Analysis of the large bowel

microbiota of colitic mice using PCR/DGGE.Lett Appl Microbiol, 2005,41:45-51.

（收稿日期：）2012-04-01

（本文编辑：陈烨）

·短篇论著·

肝癌伴动静脉瘘的造影表现

黄永东

张振岳

毛健

皇甫风华

蔡晓晴

）。腹腔干造影总量8ml ，注射速度5ml/s，压力300mgI/ml

观察血管解剖; 肠系膜上动脉造影，总量15ml ，注射速PSI ，

度5ml/s，压力300PSI ，了解有无变异的肝动脉、间接观察门静脉血流情况；肝总动脉造影，总量16ml ，注射速度4ml/s，压力300PSI ，明确肿瘤染色及判断有无动静脉瘘。

三、诊断

判断原发性肝癌是否存在动-静脉瘘，笔者认为通过肝总动脉造影，于动脉期见到门静脉或/和肝静脉显影即可明确动静脉瘘（AVS ）的存在，本组30例原发性肝癌并AVS 患者均可见上述征象，其中肝动脉-门静脉瘘25例（如图1、2、3、

启东是原发性肝癌的高发地区。原发性肝癌的治疗方法首选手术切除，对于不能手术的中晚期肝癌、术后复发的患者，目前最有效的方法是介入治疗。而肝癌伴动静脉瘘的介入治疗是肝癌介入治疗的难点[1]。如果不能正确识别肝癌伴动静脉瘘，不仅介入疗效差，而且可能导致严重的并发症。因此正确识别肝癌伴动静脉瘘的造影表现并选择相应的介入方案才能保证其疗效[2]。作者结合多年的临床工作经验，拟具体描述肝癌伴动静脉瘘的造影表现，以供参考。

材料与方法

一、材料

本组男性24例，女性6例；年龄32～75岁，平均年龄51岁。术前经B 超、CT 、MRI 、AFP 及部分患者的手术病理证实为原发性肝癌，本组病例均符合肝癌诊断标准，临床Child-无介入治疗禁忌证，所有的造影表现均伴Pugh 评分A-B 级，有门静脉或/和肝静脉瘘。

二、方法

所用机器为Siemens 公司的AXIOM Artis FA 血管造影机。高压注射器使用的是LF 的ANGIOMAT 6000。术前行碘过敏试验。采用Seldinger 技术经皮股动脉穿刺置管。常规行腹腔干、肠系膜上动脉、肝总动脉造影，对比剂为碘海醇（300

作者单位：226200江苏省启东市人民医院介入科

1. 肝动脉-门脉瘘

肝动脉内试注造影剂，血管显影浅淡或不显影; 高压造影动脉期，门静脉主干或其分支过早显影；肝动脉-门静脉瘘分为周围型（图1、）和中央型（图3、），周围型表现为动脉期24出现门静脉分支显影，有时与动脉伴行呈双轨征，也可表现为碘油栓塞时，肿瘤边缘出现枯枝状的门脉支碘油铸型，即碘油门脉显影征；中央型表现为动脉期门静脉主干及大分支显影，以及肿瘤染色出现在门静脉显影之后。中央型的患者一般分流严重，远端肝动脉显影差[3]。

2. 肝动脉-肝静脉瘘

高压造影的动脉期，肝静脉主支显影，居脊柱左侧膈顶附近，并可见造影剂回流至右心房（图5）。

（混合型）3. 肝动脉-门脉瘘合并肝动脉-肝静脉瘘门静脉瘘和肝静脉瘘的征象同时出现（图6）。二、肝动-静脉瘘的发生情况

结合本科室一年来共187例肝癌造影表现，发现肝动-静脉瘘共30例（16.0%），肝动脉-门脉瘘发生率（13.3%），肝动脉-肝静脉瘘（1.6%），有少数混合型（1.0%）。肝动-静脉瘘）；肝动脉-肝静脉瘘3例（图5）；肝动脉同时合并肝静脉及4

门静脉瘘2例（图6）。

结

果

【摘要】目的熟悉肝癌伴动静脉瘘的造影表现，提高动通过静脉瘘的识别能力。方法选取30例原发性肝癌病例，并且确定动静脉瘘DSA 造影表现来明确是否合并动静脉瘘，

的分型。结果本组30例原发性肝癌并AVS 患者中肝动脉-门静脉瘘25例；肝动脉-肝静脉瘘3例；肝动脉同时合并肝静脉及门静脉瘘2例。结论通过肝总动脉造影，于动脉期见到门静脉或/和肝静脉显影即可明确原发性肝癌是否伴有动静脉瘘（AVS ）的存在。

【关键词】肝癌；动静脉瘘；造影表现

一、肝动-静脉瘘的造影表现