分子标记辅助育种研究

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(24):10348-10350,10358 责任编辑 张彩丽 责任校对 马君叶

分子标记辅助育种研究

范吉星,邓用川

1

2*

(1.海南大学农学院,海南海口570228;2.海南省耐盐作物生物技术重点实验室,海南海口570228)

摘要 综述了分子标记选育技术的原理、基本条件、策略及应用。关键词 分子标记;辅助选择;育种;基本策略

中图分类号 S336 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)24-10348-03

StudyonMolecularMarkerAssistedSelectionBreedingFANJ-ixingetal (CollegeofAgriculture,HainanProvincialKeyLabofBiotechnologyforSal-ttoleranceCrops,HainanUniversity,Haikou,Hainan

570228)

Abstract Theprinciple,basiccondition,stratrgyandapplicationofMolecularmarkerassistedselectionbreedingwerereviewed.Keywords Molecularmarker;Assistedselection;Breeding;Basicstrategy

传统的作物育种主要是通过作物亲本杂交,然后在其后代中选择具有优良性状的个体。虽然这种通过表型选择优良性状的方法在作物育种上也取得了令人瞩目的成绩,然而由于基因型和环境之间的互作,此选择过程常遇到很多困难,另外传统育种选择程序复杂、耗时且昂贵,准确率也不高。1980年RFLP,即限制性片段长度多态性技术的问世,开创了分子标记的新纪元。分子标记技术是以生物大分子(主要是遗传物质DNA)多态性为基础的遗传标记技术,它的问世和发展为定向地对作物进行遗传操作和改良提供了可能性。而将分子标记应用于作物改良过程中进行选择的分子标记辅助选择(Marker-assistedSelection,MAS)技术,通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种,不仅弥补了传统育种中选择技术准确率低的缺点,而且提高了育种效率,显示出广阔的应用前景。随着20世纪80年代中后期PCR技术的诞生和人类基因组计划及之后的水稻等多种作物基因组计划的相继推动下,分子标记辅助选择技术的研究和应用得到迅速发展。笔者讨论了分子标记辅助选择育种技术的原理、基本条件、基本策略及其在育种上的应用情况。

1 分子标记辅助选择(MAS)技术及其基本条件

1.1 分子标记辅助选择(MAS)技术 分子标记辅助选择是将分子标记应用于作物改良过程中,借助分子标记达到对目标性状基因型进行选择的一种辅助手段[1]。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或呈共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选,从而减少连锁累赘,获得带有期望性状的个体,达到提高育种效率的目的[2-3]。分子标记按照发展阶段和技术特性大致可分为:¹第一代分子标记是以分子杂交为基础的DNA标记技术,如RFLP标记、DNA指纹技术、原位杂交等;º第二代分子标记是以PCR反应为核心的DNA指纹技术,如RAPD、AFLP、SSLP、SCAR、SSR、CAPS、STS、TRAP等;»第三代分子标记是基于基因序列的,即来自cDNA序列的新型分子标记,如cSSR、SNP以及EST标记。第三代分子标记不仅具有数目多、适于高通量检测的优点,而且能够找到稳定可靠的基于表达基因

基金项目 海南省重点科技项目(04103);海南省耐盐作物生物技术重

点实验室开放基金资助。

作者简介 范吉星(1982-),男,河南洛阳人,硕士研究生,研究方向:

植物蛋白质组学。*通讯作者。

的特定分子标记,可以更好地对基因功能的多样性进行更直

接的评估,极大地方便了对目标基因的分子标记辅助选择。1.2 基本条件 一般而言,MAS育种需要4个主要的基本条件:¹需要构建带有一定数量呈均匀间隔的多态性标记的遗传图谱,以便准确定位目标数量基因座位(QTLs)或主效基因;º目标数量基因座位(QTLs)或主效基因与邻近的标记基因要紧密连锁;»标记基因和其余基因组基因能够重组;¼经济高效地检测分析大批量植物个体。分子标记辅助选择的成功应用取决于分子标记和目标基因的位置关系,即遗传距离。若分子标记位于目标基因内部与目标基因共分离,则对于分子标记辅助选择是最理想的,也称为基因辅助选择,但这种分子标记比较少见。若分子标记与目标基因在群体中连锁不平衡,这也标志着目标基因与标记位点间存在紧密的连锁关系,通过这类分子标记的选择称为连锁不平衡选择。另外,当分子标记与目标基因在群体中连锁平衡时,应用分子标记辅助选择较为困难,一般需要使用位于目标基因两端的2个或多个分子标记共同进行选择。总体来说,标记基因与目标基因座位之间的遗传距离越小,分子标记辅助选择的准确率就越高。

2 分子标记辅助选择的基本策略

当前MAS育种的基本策略除回交育种外,主要有SLS-MAS育种、系谱MAS育种、MAS聚合育种以及新兴的以生物信息学为平台的设计育种策略等。2.1 SLS-MAS育种 Ribaut等提出了关于QTL-MAS(SingleLarge-Sale,MAS)的SLS-MAS方法,认为应用于标记辅助选择的QTLs最好不要超过3个,而且要求这些QTLs在不同的遗传背景和环境中表达稳定,所占的表型变异较大,同时选择最有效的QTL,使所用分子标记与QTL间的距离低于5cm,以得到最紧密连锁的分子标记[5]。另外,在该系统中还要考虑基因间的上位性问题[6]。

在这一策略中,首先要在优良材料中选择亲本,以便获得可通过等位基因互补改良的性状。然后通过杂交所选的亲本,建立起分离群体。每个亲本的目标基因组区域可以通过在分离群体中组合有利的等位基因而被鉴定出来。MAS依赖以PCR为基础的分子标记来定位目标基因组区域内的有利等位基因,它只需对优良品系杂交得到的大型分离群体进行一次筛选即可。这种策略有3个明显的优势:¹这些有,[4]

36卷24期 范吉星等 分子标记辅助育种研究10349

否是供体株或受体株;º带有特定基因组区域内有利等位基因的植物体在重组的早期世代中就可被筛选出来,而且目标区域外部不会有选择压力,这确保了其他基因组基因可在各种条件和环境下为开发未来的新品种而积累有利的变异;»这类策略在聚合新种质中的克隆基因或主效QTLs上的有利等位基因时有重要作用。

2.2 系谱MAS育种 这类策略[7]主要应用于优异种质系谱已知的作物,如小麦等。优质小麦材料的指纹图谱必须建立在育种项目中应用的一系列品系与随后开发的优良品种上,这些数据可以与不同选择周期中收集的表型数据结合起来,来鉴定带有目标性状的等位基因。例如,一个优良品系带有在目标环境中表现高产的等位基因,那么在此优良母系产生的后代中,该基因的频率会高于期望的随机频率。这种基因频率的变化反映了育种者进行表现型选择的结果,同时也可通过对比亲代和后代的指纹图谱数据鉴定出来。一旦目标等位基因被确定下来,在下一步从新一代到下一代优良品系的选择中,与目标基因组区域紧密连接的分子标记就能被用于快速定位目标基因。这种MAS策略在F2代或F3代分离群体中应用最为有效。

2.3 MAS聚合育种 基因聚合是指将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中。MAS聚合育种就是利用基因聚合这一方法,通过传统杂交、回交、复交技术将有利基因聚合到同一个基因组,在分离世代中通过分子标记选择含有多个目标基因的个体,从中再筛选出带有优良目标性状的单株,实现有利基因的聚合[8]。MAS基因聚合育种有以下3个基本要求:一是必须找到与目标性状共分离或至少是紧密连锁(遗传距离小于5cm)的分子标记;二是建立分子标记筛选大规模群体的有效方法;三是筛选技术应具有高度可重复性,而且要简便低耗、安全有效[9]。由此可见,运用MAS进行基因聚合与运用MAS对单基因控制的质量性状进行改良在技术要求上基本相同。只要找到与目标基因紧密连锁的分子标记,育种者就可以运用MAS的手段筛选出同时含有那些基因的个体,从中提取少量DNA即可完成筛选,既无需在早代进行抗病虫性接种鉴定,也不影响植株的正长生长发育。目前,MAS聚合育种在水稻中已取得一些成绩,这主要表现在抗性基因的聚合育种上,将不同的抗性基因聚合在到同一品种中可以提高品种抗性,拓宽抗性谱,达到持久抗性的目的[10]。

2.4 设计育种 Bernardo[11]和Peleman等[12]提出了一种新的/设计育种0(BreedingbyDesign)的概念,试图对所有在农艺上有重要作用的基因的所有等位变异进行控制。他们提出只要了解这些重要农艺性状的遗传背景和等位变异的位点,育种者就能通过计算机来设计优良基因型,这样分子标记不但可以加快选择过程,而且大大有利于产生带有目标性状的新基因型。作物分子设计育种发展到目前,已经形成相对成熟的概念,它是以生物信息学为平台,以基因组学和蛋白组学等若干个数据库为基础,综合作物育种学流程中的作物遗传、生理、生化、栽培、生物统计等所有学科的有用信息,根据具体作物的育种目标和生长环境,在计算机上设计最佳方案[13]主要涉及3个步骤:¹定位所有相关农艺性状的QTL(主要通过渗入系);º进一步进行染色体单体型分析和所有相关农艺性状的表型分析,评价这些位点的等位变异;»建立设计育种方案,设计含有有利等位基因的优良基因型,开展设计育种。与常规育种方法相比,作物分子设计育种首先在计算机上模拟实施,考虑的因素更多、更周全,因而所选用的亲本组合、选择途径等更有效,更能满足育种的需要,可以极大地提高育种效率。但是这种策略的成功本质上还要依赖于充足的分子标记图谱和精确的表型分析。

值得指出的是,分子设计育种在未来实施过程中涉及面很大,它不但需要将各种技术工具与当前可用于培育优良品种的各种材料充分整合起来,相互补充,而且它还是一个融合分子生物学、生物信息学、遗传学、计算机学、作物育种学、等多种学科的综合工程。

3 分子标记辅助选择在作物育种上的应用

分子标记辅助选择是一项极有潜力的育种新技术,利用分子标记辅助选择能加速品种遗传改良的进程,极大地提高育种效率,减少育种过程的盲目性和周期性。目前MAS在作物育种上的应用主要在质量性状和数量性状的选择这2个方面。

3.1 在质量性状选择与改良中的应用

3.1.1 在基因聚合中的应用。将分子标记辅助选择进行基因聚合应用于作物改良的实践已取得一些实质性进展,这主要表现在抗性基因的聚合上,育种专家将多个控制垂直抗性的基因聚合在同一品种中,从而提高作物抗病的持久性。在这一过程中,一般只考虑目标基因选择,而不考虑遗传背景。这在水稻抗性育种中已取得显著成绩。在抗白叶枯病基因的聚合中,Huang等成功地利用MAS在F4代将4个抗白叶枯病基因Xa4、Xa5、Xa13和Xa21聚合到IRBB60品系中[14],聚合后的品系比原品系的抗谱更广、抗性更高。Yoshimura等通过RFLP和RAPD标记将来自不同组合的5个白叶枯病抗性基因Xa1、Xa3、Xa4、Xa5和Xa10聚合在一起,其中具Xa4+Xa10的纯系出现了原单个抗性基因所没有的新抗性类型[15]。徐建龙等在3个晚粳品系中聚合了抗白叶枯病基因Xa3和Xa5,聚合后的抗性水平和抗扩展能力均强于双亲[16]。Singh等把3个水稻白叶枯病抗性基因Xa5、Xa13和Xa21进行分子标记辅助聚合,获得了含2个或3个白叶枯病抗性基因的品系[17],该品系在自然条件下表现出较高的抗性谱,并把上述3个基因聚合到PR106籼稻品种中。倪大虎等将抗白叶枯病基因Xa21和抗稻瘟病基因Pi-9(t)聚合到一起,获得4个含双抗基因的株系[18]。何光明等通过分子标记辅助选择结合回交转育,首次成功进行了抗衰老IPT基因、抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi-6的聚合,并向两系杂交稻亲本进行转移[19]。在抗稻瘟病基因的聚合中,Zheng等通过MAS将稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2、Pi4聚合到同一品种中,获得了同时包含3个抗稻瘟病基因的植株[20]。Hittalmani等将稻瘟病抗性基因Piz-5、Pi1、Pita进行聚合,获得含有Piz-5的2或3个抗性基因比单独存在时抗性增强,能感染单个基因的兼性生理小种不能侵染抗性基因,[21]。

3.1.2 在基因渗入中的应用。基因渗入是通过回交将供体材料如遗传种质或育种中间材料中的有用基因渗入(转移)到目标材料,从而达到改良其个别性状的目的。在这一过程中,可同时进行前景选择和背景选择。Chen等以IRBB21为供体材料,对生产上广泛使用的/明恢630进行MAS改良,找到4个与Xa21紧密连锁的PCR标记。其中RG103、248与Xa21共分离,C189、AB9分别在Xa21两侧0.8和3.0cm处,并且选用了标记间最大图距不超过30cm均匀分布于每条染色体的128个RFLP标记用于背景选择。通过两代正向选择和负向选择,将导入片段限定在3.8cm以内。在BC3F1代的250个抗性单株中,运用RFLP标记选择到2株除目标区域外遗传背景完全恢复为/明恢630的个体,自交一代后运用标记248选出基因型纯合的抗病单株,从而得到改良的/明恢630[22]。彭应财等[23]和童海军等[24]选育出抗病(Xa21)审定组合协优218和Ò优8220。王春明等利用抗叶蝉基因Grh2的CAPS标记,选出聚合抗叶蝉基因的重要水稻中间材料[25]。Liu等应用MAS技术将抗稻瘟病基因Pi1回交转到/珍汕970中,得到背景恢复达97.01%的抗病材料[26]。王新望等利用3个SCAR标记对5Bph1b单体进行MAS,仅3个世代就获得了3个冬小麦ph1b中间育种系[27],大大缩短小麦育种年限,加快了育种进程。夏军红等通过MAS与传统选育相结合的手段,将玉米S组CMS恢复主效基因Rf3进行有效转移,选出新型的恢复系MO17(Rf3)和HZ85(Rf3)[28]。

3.2 在数量性状选择与改良中的应用 作物中大部分的农艺性状是由多基因或QTL控制的数量性状,在这样一个多基因体系中,采用传统的育种途径对这些性状进行选择有很大的难度,将MAS应用于数量性状改良则可大大提高选择的效率。一个典型的例子来自玉米杂交优势的遗传改良试验研究。该研究用76个标记对控制玉米产量杂种优势的QTL进行定位鉴定,然后将自交系Tx303和Oh43中的有利等位基因分别转入到自交系B73和Mo17中。最后获得了116个改良的B73@改良的Mo17的组合,比原始的B73@Mo17组合和一个高产组合先锋杂交种3165皆增产10%以上。另外,Schneider等用5个RAPD标记应用分子标记辅助选择对大豆进行抗旱性改良,结果在干旱条件下产量同比增长11%[30];Tanksley等利用分子标记辅助选择实现了多个QTL从野生近缘种向优良的栽培稻品种的转移[31];Bernacchi等将野生番茄中特定的QTL应用MAS导入到现代番茄品种中,经过改良,其产量、固形物含量、色素含量分别比原品种提高48%、22%、33%[32];Ioannidoua等将抗水稻黄斑病毒的主效QTL转到改良品种IR64中,创建近等基因系,接种后的抗病性明显提高[33];Kellya等在菜豆和豇豆中建立了500个分子标记的连锁图谱,并定位了许多相关农艺性状,发现一些抗病主效基因成簇分布在染色体的特定区域,并应用MAS改良了品种特性[34]。但是,由于数量性状遗传的复杂性,与由单基因控制的质量性状相比,采用分子标记辅助选择对数量性状的改良仍存在一些问题,要想明显提高目标性状,则需要同时对多个QTL进行操作,另外由于QTLs与环境以及彼此之间互作,会影响数量性状基因定位的准确性,以及对QTL的效应估计发生偏差。

[29]

4 前景与挑战

目前MAS主要还是应用于单基因遗传性状的改良育种上,在数量性状改良应用上还有所限制。在功能基因组学领域的研究取得了巨大的进步,可以通过整个基因组规模对基因的功能进行分析。一批新的技术如DNA芯片技术、微阵列技术及EST等涌现出来,在样品RNA水平的数量评估中起到很大的作用,同时也对育种者通过RNA表达层面选择优良品系有很大帮助。这些新方法不仅有望识别更多的涉及不同调控途径的基因,而且使分子育种领域也迎来了巨大的变革。今后,数量遗传学可以从基因组学中获取更多信息,从而发展出更多有意义的模式生物,基因组学也寄希望于数量遗传学发展和验证那些复杂基因相互作用的假说,而生物信息学在推动这些学科交叉中将扮演重要的角色。因此把基因组学、生物信息学与分子育种整合起来有望给植物育种带来更多根本的变革。但是应该清醒地看到,经过分子标记辅助选择途径选育的新材料不仅应用于大田的新品种,还要经过进一步的田间检验,才能把改良后的优良性状稳定地传给后代。因此,只有将分子生物学技术和传统育种融合起来,取长补短,才能在未来的作物育种工作中取得长足的进步。

可以预见,在未来十几年中,随着第三代分子标记技术的不断完善和发展,水稻等多种作物基因组计划的相继推动,分子标记辅助选择育种与基因组学、生物信息学和育种、检测程序更加密切地结合,育种工作有望迎来新一轮革命。参考文献

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(下转第10358页)

保守结构域,UPF0004超家族、RadicalSAM超家族和MiaB结构域。UPF0004超家族位于Prosite超家族的N端,其C端与MiaB蛋白有关。尽管不知其确切功能,这个结构域总是发现与pfam04055和pfam01938的连接处。MiaB结构域是多位点的,编码2-methylthioadeninesynthetase酶,在翻译核糖体构建中起作用。

用ProtFun2.2软件预测斑马鱼CDKAL1基因编码蛋白的功能分类,推测该蛋白的可能功能是酶、异构酶或者中间代谢产物。

2.5 构建系统进化树 利用ClustalX(1.83)软件的BootstrapN-JTree方法构建系统进化树,选择具有与此基因相似的9个物种(D.rerioR.norvegicusG.gallusM.musculusH.sapiensD.melanogasterC.elegansA.thalianaC.reinhardtii)进行比对,采取默认参数进行构建,结果显示D.rerio,和A.thaliana的这一基因相似性较高,M.musculus和R.norvegicus的相似性很高,并与G.gallus在进化上有较近的遗传距离,说明基因编码蛋白质的变异不大,另外C.elegans与C.reinhardtii的差异很小(图2)

。

3 结论与讨论

生物信息学是包含生物信息的获取、处理、储存、传递、分析和解释的所有方面的一门学科。它综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具进行研究,目的在于了解大量的生物学意义[4]。笔者运用生物信息学方法对斑马鱼CDKAL1基因,从基因序列、编码蛋白的理化性质、结构及功能进行分析。分析结果发现,此基因一部分存在于细胞质,并存在一个跨膜结构域,没有信号肽。基因编码蛋白含有3个功能结构域,均为ErkD-domain,分别位于L189、L384、V315,在Y292位置有一磷酸化位点。有UPF0004超家族、RadicalSAM超家族和MiaB结构域3个保守结构域,在脑、肌肉、肾脏中表达。推测该基因表达的蛋白质与胰岛素受体的作用有关,此分析结果可为今后进一步研究人类Ò型糖尿病提供依据。在生命科学和医学的研究和应用中,利用生物信息学分析可以大大提高研究开发的科学性及效率,如根据蛋白质分析结果研究某些疾病的发病机理并进行新药设计[5]。随着分子生物学技术和计算机科学的迅猛发展,生物信息学以其大规模信息量、快速等优势已成为推动基因组学和后基因组学研究的一项重要技术,必将加速生命科学研究。参考文献

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图2 系统进化树Fig.2 Phylogenetictree

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