免疫比浊法测C反应蛋白

免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。

抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了检测的速度、灵敏度和易操作性。 免疫比浊测定注意事项：

1、抗原或抗体量大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差。

2、应维持反应管中抗体蛋白始终过剩。

3、易受到脂血的影响。

分类

1.免疫透射比浊法 抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。

2.免疫散射比浊法 一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。

3.免疫胶乳比浊法 胶乳比浊法即是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。

实验八 免疫比浊法测定C-反应蛋白

【原理】

血清C反应蛋白（CRP）与试剂中抗人CRP抗体结合，形成免疫复合物，一起吸光度增加，在波长340nm和700nm处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加

量，即可定量检测血清中CRP的含量。

【试剂】

1．0.1 mol/L的Tris缓冲液。

2．羊抗人CRP抗血清。

3．CRP定标液。

【操作步骤】 见表8-1。

表8-1 免疫比浊法测定C反应蛋白操作步骤

CRP定标液(μl) － 15 －

生理盐水(μl) 15 － －

缓冲液(μl) 350 350 350

混合，于37℃保温5 min，在波长340nm和700nm处

读各管吸光度(A1340、A1700) 抗人CRP抗血清 (μ50 50 50

l)

混合，于37℃保温5 min，在波长340nm和700nm处

读各管吸光度(A2340、A2700)

【计算】

HDL-C含量 (mmol/L)＝

【参考范围】 × 标准液浓度 ⊿A＝(A2340－A2700)－(A1340－A1700)

血清C反应蛋白＜4mg/L(各实验室应有自己的参考范围)

【注意事项】

1．使用新鲜血清，并尽可能快地检测。

2．试剂不能冷冻保存。

【临床意义】

CRP是一种急性相蛋白，肝脏是其主要的合成器官。最近研究表明，人体其他部位如冠状动脉平滑肌细胞、神经元细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、肾小管上皮细胞等在炎症刺激或病理状态下都能合成和分泌CRP。正常情况下，CRP以微量存在于健康人的血清中，但在机体有细菌感染、组织损伤、肿瘤形成等急性相刺激时，CRP水平可升至正常的100倍甚至更高。测定CRP对于鉴别感染、监测疾病活动情况及严重程度、器质性疾病的筛检、监测器官移植受体排斥反应及疗效观察、冠心病等急性血管意外事件的预测与诊治等有很好的导向作用。

【评价】

CRP的检测方法从灵敏度较低的免疫扩散法、火箭电泳法、胶乳凝集试验到高灵敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比浊等定量试验。多数情况下，

半定量的胶乳凝集试验适合于筛查，但其影响因素多、灵敏度较差和不能精确定量。对于需作较精确的CRP定量测定，免疫浊度法较为合适。其他方法如ELISA、免疫发光法和化学发光法虽然灵敏度和精确度都较高，但其成本也较高,故不是理想的临床实验室的常规方法。

1材料与方法

1.1兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备

1.1.1兔抗人白蛋白抗体的制备采用25％人血浆白蛋白注射液，按常规免疫新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清（效价1:32），经饱和硫酸铵沉淀后，过DE－52层析柱，IgG峰部洗脱液用Follin酚法于540nm处定量测定IgG蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。

1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取10％羧化聚苯乙烯胶乳悬液（军事医学科学院动物中心产品，Φ=0.6μm），用pH8.2甘氨酸缓冲液（GBS）稀释成1％浓度，将其于兔抗人白蛋白IgG按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏胶乳[2]。

1.2敏感性试验

取25％人血浆白蛋白20μl，加入生理盐水180μl，再经系列稀释成10个浓度，其浓度范围在25mg/ml～3.125ng/ml之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做3次重复检测。

1.3特异性试验

将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至5％、2.5％和1.25％，用兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测。

1.4重复性试验

用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对5份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7次重复检测，同时设阴性对照。

3讨论

兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的白蛋白。而检测粪微量白蛋白作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA

法对粪潜白蛋白（Occultalbmin）进行定量检测，并认为其敏感性优于便潜血。1993年，我们制备和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂和反向胶乳凝集试验，检测了378例已知患者和正常人粪便标本，其临床结果显示：56例大肠癌诊断敏感性55.4％，特异性82.6％；132例正常人阳性率17.4％。近来我们增加了已知患者数量，重新检测了161例正常人粪微量白蛋白，结果表明：在增加受检人数后，提高了大肠癌的诊断敏感性（76.8％），而特异性则无显著差别（80.0％）；161例正常人阳性率为19.2％，比原来的132例正常人阳性率高1.8％。实验结果显示：在受检人数增多的情况下，用该试剂检测粪微量白蛋白可能会达到提高诊断敏感性，保持特异性的良好效果。

C-反应蛋白检测试剂盒（全量程）试制工作总结

一、概 述

C反应蛋白（C-reactive protein）是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白，半衰期19小时；血清CRP由肝脏合成，白细胞介素1b、6以及肿瘤坏死因子是其合成的最重要的调节因子；CRP的分子量为105 500，由含有五个相同的未糖基化的多肽亚单位组成，每个亚单位含有187个氨基酸，这些亚单位间通过非共价键连结成环状的五聚体，并有一个链间二硫

键。

1930年，Tillett和Francis首次在急性大叶性肺炎患者的血清中发现一种能 在Ca2+存在时与肺炎球菌细胞壁中的C－多糖发生特异性沉淀反应的物质。1941年， Avery等测知它是一种蛋白质，故称为C反应蛋白(CRP)。1944年，Jones将其作为临床风湿热诊断标准的次要指标之一。后来，人们在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了CRP，于是人们认为，CRP是组织损伤的一种非特异性反应。进一步研究发现：病毒或细菌感染、梗塞、免疫复合物沉积等因素都可导致组织损伤。在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显著增加，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，其中CRP是急性时相蛋白中变化最显著的一种。CRP在正常人血清中其含量极微；在组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时CRP可以在数小时内急剧上升，可增高数倍或数百倍，2-3天达峰值，待病情改善时逐渐下降，恢复正常。CRP被广泛应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，其升高可见于：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术后感染及并发症的指标：手术后病人CRP升高，术后7—10天CRP水平应下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清CRP升

高，而病毒性感染则多数不升高。

超敏C反应蛋白（ High sensitivity C-reactive protein）与CRP并不是两种蛋白，只是从灵敏度上加以区分, 超敏C反应蛋白(Hs-CRP)最低检测限达0.1 mg/l; 原先认为CRP是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关,大量研究资料表明,动脉粥样化的血栓去除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症过程,；Hs-CRP轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独

立的危险因素； HS-CRP已被证实是由慢性炎症引发心血有较高的灵敏度但线性较低，这样就出现了一种试剂两种名称，用途也有所区别；近几年来，随着检验技术的发展，开始出现了一种全量程CRP，这种CRP即能满足较高的灵敏度，又能满足较高的线性，如日本一化，申索佑福等，我公司通过与中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程CRP的试制，经公司自检与医院试用，结果表明与免疫散射比浊法一致性好；公司已计划于近期完成临床与注册，正式推向市

场；

二、国内外研究情况

2.1临床研究

CRP作为一种急性时相反应蛋白，被广泛应用于临床。

2.1.1用于细菌和病毒感染的鉴别诊断

当细菌感染引发炎症，在炎症进程开始4～7小时就可开始升高，且升高的幅度与细菌感染的严重程度相一致，病毒感染时CRP不增高，以此鉴别感染的性质，指导临床治疗，减少不管疾病的独立危险因素，检测其浓度对心血管疾病的干预及预后起重要作用而被临床重视。流行病学调查也显示,hs-CRP 水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2 倍, 发生心肌梗死的几率是正常者的3 倍 。2003 年欧洲高血压防治指南( ESH/ESC) 正式推荐, 高血压患者

需检测hs-CRP 水平。

目前国内用于全自动生化仪的免疫透射比浊法试剂CRP出现了两种（普通CRP与超敏CRP），普通CRP有较高的线性但灵敏度不好，超敏CRP必要的抗生素治疗，有效防止抗生素的滥用。这些感染临床上常见于肺炎、支气管炎、咽喉炎、细菌性脑膜炎、伤寒、化脓性关节炎、尿路感染、骨盆炎、阑尾炎等等。在鉴别细菌或病毒感染方面，比白细胞计数及分类计数更准确，特别是老年人，免疫系统反应顺应性下降，可能有感染发生但临床上并无发热、白细胞升高等情

况，此时检测CRP有助于检出细菌感染。

2.1.2肿瘤监测

CRP的测定用于肿瘤的治疗和预后：CRP术前上升,术后下降，不受放疗、

化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床评估肿瘤的进程。

2.1.3监控病情变化及术后感染，并用于抗生素疗效观察

CRP在血中升高的幅度与感染的程度正相关。有研究表明，术后6小时左右，CRP开始升高，如无并发症应在术后三天下降直至正常，如术后出现感染，则CRP长时间不下降；术前CRP升高者，术后感染率也远高于术前CRP不高者。对于烧伤病人，可检测CRP以警示是否发生败血症，以便及时应对治疗。对疑有败血症的新生儿，在24～48小时内作CRP的动态监测，可作为是否停止抗生素治疗的可靠依据，而血培养的时间则需更长，培养结果出来之前无法排除败血症。对细菌感染作抗生素治疗时，动态检测CRP是必要的，它比临床体征更早作出并发症警报和治疗效果的判定，在粒细胞缺乏症或机体免疫状态抑制

时更有临床意义。

2.1.4用于评估急性胰腺炎的严重程度

入院时CRP>110mg/l，可能是出血性胰腺炎（临床灵敏度８８％，特异性９４％）；当CRP>250mg/l时,可提示为广泛性坏死性胰腺炎。

2.1.5风湿病

类风湿性关节炎患者CRP与疾病相关性较大，比临床症状出现要早4-6周。

2.1.6肺部感染

肺炎在年老人群中较难诊断，通常不大有发热。在许多情况下ＣＲＰ>100mg/l，提示细菌感染，如肺炎或化脓性支气管炎。典型的病毒性肺炎不会

超过50mg/l。

2.1.7儿科感染性疾病：

在儿童急性淋巴细胞白血病常发性细菌败血症，CRP超过100mg/ L,则视为有细菌感染;儿童CRP细菌性脑膜炎时平均195mg/L，而病毒性脑膜炎则低得

多。

2.1.8肾脏移植排异

移值后8天CRP下降至正常，如发生排斥反应则血清肌酐、尿氮、CRP皆升高。CRP升高在排斥反应发生之前4天出现。但是，感染也可发生CRP升高，要注

意两者鉴别。

2.1.9 心血管疾病

随着检验技术的发展,原先认为CRP是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关,大量研究资料表明,动脉粥样化的血栓去除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症过程,；CRP轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病

相关，是一项独立的危险因素；

① 未来发生心血管疾病发病率和死亡率的预测指标

Hs-CRP是健康人未来发生心血管事件一个有价值的预测指标，许多研究证实Hs-CRP能预测首次心肌梗死和疾病的发作，内科健康研究（PHS）显示，Hs-CRP位于最高四分位数的病人未来发生卒中危险增加2倍，未来发生心肌梗死危险增加3倍，未来发生周围血管疾病的危险增加4倍。这种预测作用长期稳定存在于吸烟和非吸烟者中，且独立于其他危险因素。Hs-CRP是已知CHD病人未来心血管病发病和死亡的预测指标，欧洲ECTA研究组的资料显示，稳定性心绞痛（SAP）和不稳定性心绞痛（UAP）病人Hs-CRP浓度每升高一个标

准差，非致命性心肌梗死或心脏性猝死的相对危险增加45%。

② 急性冠脉综合症（ACS）的预后指标

Hs-CRP测定对ACS的预后价值，首先是在急性局部缺血和不稳定心绞痛

的病人中提出的，

重度不稳定型心绞痛（UAP）病人入院时若Hs-CRP≥3mg/l 比Hs-CRP﹤3mg/l 者心绞痛复发、冠状动脉血管置换术、心肌梗死和心血管疾病致死等心血管事件发生率高；出院时测Hs-CRP比入院时测能更好的预测90天的不良后果；检测Hs-CRP有助于鉴别心肌钙蛋白（cTn）阴性而病死率增高的病人,应

联合合使用cTn与Hs-CRP来评估ACS危险程度,ACS病人入院时

Hs-CRP≥5mg/l 与半年内严重心脏病发病率升高相关,而不管cTn值如何。

③ 与TC/HDL-C联合预测冠心病危险

在冠心病的危险性研究评估时, Hs-CRP与血脂指标是独立的变量,将两者同时检测并联合分析,在诸多变量分析过程中,记录诸多冠心病危险因素如肥胖\高血压\糖尿病\冠心病家族史等，各种生化指标中仅Hs-CRP与TC/HDL-C有单独

的预测价值,两者联合意义更大。

2.2国内外试剂盒发展

CRP的测定方法较多，一般分为定性与定量两种。定性方法有：用纯化了

的肺

炎球菌C-组分与病人血清反应的沉淀法、肺炎球菌荚膜肿胀试验、特异性

抗血

清与CRP反应的毛细管沉淀试验、补体结合试验、乳胶凝集试验、乳胶扩

散沉

淀试验等，但它们的灵敏度低，只用于定性检测。定量检测的有：放射免疫

(RIA)、

荧光免疫(FIA)、酶标免疫(ELISA) 、速率散射比浊法（INA）、胶乳增强透

射比

浊法（ITA）； 定性与定量相结合的方法有：快速检测卡结合仪器法；其中

放射

法对人伤辐射伤害较大，已较少使用，荧光免疫(FIA)或化学发光需专用仪

器且

成本高，ELISA法多数为半自动操作，出结果慢，不适合批量检测；速率散

射比

浊法（INA）需与比浊仪搭配使用，增加了仪器成本；快速检测卡结合仪器

法只

是半定量试剂，不能准确定量；胶乳增强透射比浊法（ITA）是目前医院较

多使

用的方法之一。目前国内有两种试剂，即普通CRP与超敏CRP，一个项目，

两种

试剂，给用户带来了不便；随着检验技术的发展，近几年已出现了一种即有

高线

性又有高灵敏度的试剂，即全量程CRP，目前国外已有Orion公司、日本

一化，申

索佑福等公司推出了此种试剂，我公司通过与中科院上海生物研究所合作，

近期已完成全量程CRP的试制，经公司自检与医院试用，结果表明与免疫

散

射比浊法一致性好；公司已计划于近期完成临床与注册，正式推向市场；全

量程

CRP即有普通CRP的高线性，又有超敏CRP的高灵活敏度，因此，CRP

即可

作炎症标志物，也可用作Hs-CRP用于心血管疾病的预测与预后。

三、试制过程

目前，测定CRP的方法有很多，定性或半定量方法由于不是准确定量，已

较少

使用；定量方法放射免疫(RIA)、荧光免疫(FIA)、酶标免疫(ELISA) 、速率散射比浊法（INA）、胶乳增强透射比浊法（ITA）等中以后两种使用较多； 目前国外已有Orion公司、日本一化，申索佑福等推出了胶乳增强透射比浊

法试

剂，国内大多为进口试剂，我公司通过与中科院上海生研所合作，已完成小

样制

备，并计划于近期报批上市。

3.1原理与试剂成份

血浆中的CRP与试剂中胶乳包被的特异性抗体相结合，形成抗原抗体复合物产生混浊;在一定的抗体浓度范围内,其浊度高低与血清CRP含量成正比。通过测定特定波长的吸光度值，查标准曲线即可求出血清中CRP的含量。

试剂成份： 磷酸盐 100mM 表面活性剂复合抗体

当光线通过个浑浊介质溶液时,由于溶液中存在混浊颗粒,光线被吸收了一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比,这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。因有抗原抗体反应，固称为免疫透射比浊法，为增强灵敏度，采用胶乳增强免疫比浊法。抗原与抗体在一定条件下才能形成复合物，一定条件包括：

① 抗体的要求

抗体要求效价高（保持高线性），纯度高（如不纯，则有可能含其它抗体而有非特反应从而导致结果偏高），亲和力要强（亲和力强生成的抗原抗体复合物

才稳定，不易解离）

② 抗原抗体比例要求

免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是形成抗原抗体复体物，第二阶段是复合物交联形成大网格结构，第三阶段是复合物聚合而形成沉淀。只有在抗体过量时，其浊度才会随着CRP的增加面增加，若抗原过剩则会出现HOOK效应而

导致结果偏低而不准；

③ 促进剂与稳定剂

一般要求溶液中有非离子性亲水性多聚体促进免疫复合物的形成，如

PEG6000，含量3-4%。

④PH一般在6.5-8.0之间,过酸过碱均会破坏试剂中抗体与样本中的抗原。

3.2 胶乳的选择与制备

由于测定用的波长与粒径大小有关,因此粒径的均一性是影响测量精密度与均确度的一个重要因素。公司选用聚苯乙烯胶乳，聚苯乙烯胶乳用乳液聚合法制备小分子纳米（25-50nm），采用微孔过滤技术，保证颗粒大小的一致性，小分子纳米颗粒较一般颗粒（100-300nm）颗粒更小，不易发生自沉；过滤后的胶乳进行羧化，使羧基均匀分布于胶乳的表面。再把羧化的胶乳与D-二聚体抗体结合，结合方式包含物理吸附与化学交联两种，以增强抗原捕获能力，缩短反应时间，整过反应过程在3-5分钟内结束，且化学交联后形成的抗原抗体复合物

更紧密，不易解离，结果更准确，精密度更好。

表一、小分子纳米技术与化学交联技术应用后的D-二聚体的精密度与准确

度

②胶粒带电情况，一种胶乳的粒子都带有相同电荷，同性相斥，胶粒带电量

越大，排斥越大，越不易自沉； ③胶粒之间的溶剂膜，这种液膜有反抗二固体接近的排斥力，这种排斥力与

缓冲液、合适的PH，稳定剂等相关； 我公司选择CC+PEG作为促进剂与稳定剂，与明胶、PEG，葡聚糖相比稳

定时间更长，提升了试剂的有效期 表六、稳定剂与有效期(以测量结果与靶值偏差≦10%为依据)的关系

研究结果表明，2种检测方法在3～5、5—10和>10 mg／L范围内测定hs-CRP浓度的相关系数分别为0、996、0．995、0．982，表明2种检测方法的相关性较好。而在

检测快速，敏感性高，对检测微量的hs-CRP更为理想p1。本研究还发现，在高浓

度的hs—CRP测定中，如hs-CRP浓度>10 mg／L，由于抗原过量，乳胶增强透射免疫比浊法测定时，hs-CRP浓度明显超出了检测限上限，会发生测定结果显著低于实际含量或无法测出的现象。而在速率散射免疫比浊法中，为保证准确性和精确性，仪器设计有抗原过量检测系统。提示应将待测标本进一步稀释，重新进行检测。以获取全部抗原的真实浓度，本研究通过5倍稀释标本，得到了较高浓度hs-CRP的精确值。由此看来，速率散射免疫比浊法在低值和高值测定中优于乳胶增强透射免疫比浊法。