9种金属离子对缢蛏消化酶活力的影响

第10卷第4期2003年8月

中国水产科学

JournalofFisherySciencesofChina

Vol.10No.4Aug.,2003

9种金属离子对缢蛏消化酶活力的影响

吴众望,潘鲁青,董双林

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛 266003)

摘要:以酶学分析的方法研究9种金属离子(Cu2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+、Zn2+、Ca2+、Pb2+、Ag+和Mn2+)对缢蛏(Sinonovaculaconstricta)蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力的影响。缢蛏壳长(5 64 0 25)cm,9种金属离子浓度分别设置为2 10-6mol/L、2 10-5mol/L、2 10-4mol/L、2 10-3mol/L、2 10-2mol/L5个梯度。实验表明,缢蛏3种消化酶活力大小为淀粉酶>蛋白酶>纤维素酶;在实验设置的浓度范围内,Cu2+、Fe3+、Mg2+、Pb2+对蛋白酶活力影响不显著,Hg2+、Zn2+、Ca2+、Ag+、Mn2+对蛋白酶活力影响显著;Mg2+、Pb2+对淀粉酶活力影响不显著,Cu2+、Fe3+、Hg2+、Zn2+、Ca2+、Ag+、Mn2+对淀粉酶活力影响显著;Ca2+、Mg2+、Zn2+对纤维素酶活力影响不显著,Pb2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、Mn2+对纤维素酶活力影响显著。不同浓度金属离子对缢蛏蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力的影响表现出不同的变化趋势。关键词:金属离子;缢蛏;蛋白酶;淀粉酶;纤维素酶

中图分类号:Q558 9 文献标识码:A 文章编号:1005-8737-(2003)04-0297-04

国内外关于贝类消化酶的研究主要集中在分析消化器官中某些消化酶的存在、性质和将消化酶作为工具酶进行多方面应用等[1-9],如刘万顺等[9]研究了紫贻贝(Mytilusedulis)、滨螺(Littorinasp.)的消化酶活性的大小。而有关金属离子对贝类消化酶活力的影响的报道甚少[5-6]。本研究以缢蛏为材料,探讨9种金属离子对其消化酶活力的影响,并分析金属离子对缢蛏消化酶的影响机制,旨为深入研究金属离子消化生理研究和洁净养殖生产提供科学依据。1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用缢蛏2001年10月购于青岛市南山水产品市场,壳长4.25~6.85cm,平均壳长(5.64 0.25)cm。去除其表面附着物,置水族箱中以砂滤海水暂养5d,然后终止投饵,饥饿48h后,将缢蛏置冰盘内解剖,取出胃和消化盲囊,并去除多余的组

收稿日期:2002-08-15; 修订日期:2003-01-12 基金项目:国家重点基础研究规划项目(G1999012011)

作者简介:吴众望(1980-),男,硕士,从事水产动物生态毒理学的研究 E-mail:[email protected]

织块,作为酶液制备的样品,缢蛏取样数量为60只。1.2 酶液的制备

将上述样品用重蒸水冲洗,加入预冷的重蒸水(0~4 ),加入比例为1mg样品/(10~15)mL重蒸水,在冰浴中用玻璃匀浆器充分研磨匀浆(10~20min),将匀浆液在Sigma1-15K型高速冷冻离心机以0~1 ,10000r/min离心30min,取组织匀浆上清液作为酶液,在0~4 低温下保存,于24h内分析完毕。

1.3 金属离子的种类、浓度及来源

9种金属离子的种类与来源见表1。其浓度根据预试验的结果设置为2 10-6mol/L、2 10-5mol/L、2 10-4

mol/L、2 10-

3

mol/L、2 10-

2

mol/L5个梯度,所有梯度均设置3个重复,不加金属离子组为对照组。1.4 酶活力的测定

取0.25mL酶液加至0.25mL不同浓度的金属离子溶液中,充分混匀10min,然后进行酶活力测定。5个浓度9种金属离子酶活力的测定均设置3个重复组。蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力测定参照 生化技术导论 的方法,并根据范德鹏等的,[10]

298 中国水产科学 第10卷

pH9.2、6.3、5.2;温度55 、65 、45 ,上述各测定方法均有改进1)。酶液蛋白含量以牛血清蛋白作标准,用双缩脲法测定。酶活力以比活力表示(U/mg蛋白),设对照组酶活力为100,其他实验组的酶活力以实测酶比活力与正常酶比活力的比值表示,并采用ANOVA单因素方差分析和Duncan多重比较进行显著性检验。

表1 金属离子的种类和来源Table1 Metalionsandtheirsources

金属离子MetalionAg+Ca2+Cu2+Fe3+Hg2+Mg

2+

不显著;Hg2+低浓度时表现促进或不显著,在高浓度时表现为抑制作用;Mn2+表现为抑制作用,且在低浓度较强;Zn只在2 10mol/L表现促进作用,其他浓度均为抑制作用,2 10-6mol/L时表现为最大的抑制作用。

2.3 金属离子对纤维素酶活力的影响

对照组的缢蛏纤维素酶实测酶比活力为(0.543 0.0197)U/mg蛋白。由表4可见,Ca2+、Mg2+、Zn2+对纤维素酶活力影响不显著,其他金属离子影响显著。Ag+、Fe3+、Hg2+在高浓度时表现为抑制作用,低浓度时影响不显著;Cu2+在2 10-2

2+

-5

来源SourceAgNO3CaCl2CuSO4Fe(NO3)3HgCl2MgSO4MnCl2Pb(NO3)2

ZnSO4

mol/

L、2 10-4mol/L表现为抑制作用,Mn2+在2 10-2mol/L、2 10-6mol/L表现为促进作用,其他浓度影响不显著;Pb2+除在2 10-2mol/L时影响不显著外,其他浓度均表现为显著促进作用。

表2 金属离子对缢蛏蛋白酶活力的影响

Table2 ProteaseactivitiesofSinonovaculaconstrictaunder

effectsofdifferentmetalions

金属离子

金属离子浓度/(mol L-1)Concentrationofmetalion

2 10-62 10-52 10-42 10-32 10-123.82b126.47b124.28b113.94b109.33a105.28a

88.39ac76.72c

91.10a

102.51a100.40a

98.12a92.25a

2

Mn2+

Pb2+Zn2+

2 结果

2.1 金属离子对蛋白酶活力的影响

对照组的缢蛏蛋白酶实测酶比活力为(1.47 0.72)U/mg蛋白。由表2可看出,Cu2+、Fe3+、Mg、Pb对蛋白酶活力影响不显著,其他金属离子影响显著。Ag+在2 10-2mol/L浓度下,表现为抑制作用,其他低浓度均为促进作用;Ca2+在2 10mol/L浓度时,Hg、Zn在2 10mol/L浓度下均表现为显著性抑制作用,其他浓度与对照组差异不显著(P>0 05);Mn2+除2 10-2mol/L浓度与对照组差异不显著,其他浓度均表现为显著性抑制作用。

2.2 金属离子对淀粉酶活力的影响

对照组的缢蛏淀粉酶实测酶比活力为(126 53.5)U/mg蛋白,测定结果见表3。Mg、Pb对淀粉酶活力影响不显著,而其他金属离子影响显著。Ag+表现为显著抑制作用,且在高浓度时抑制作用较强;Ca2+在2 10-5mol/L时有最强的抑制作用;Cu在2 10mol/L、2 10mol/L和Fe在

-5

2 10mol/L时都表现为促进作用,其他浓度影响

1)范德鹏.温度、pH对缢蛏消化酶活力的影响.海洋湖沼通报,待发表.

2+

-3

-6

3+

2+

2+

-4

2+

2+

-2

2+

2+

Metalion 0Ag+Ca2+Cu2+Fe3+Hg2+Mg2+

Mn2+Pb2+Zn2+

100a100ab100a100a100a100a100a100a100a

74.10c87.72a63.33b

81.32bc102.72ab

99.55a102.98a103.13a105.47a

100.27a104.60a100.96a

106.57a111.27a100.19a108.24a106.07a82.10b81.58b78.52b82.41b109.05a118.64a117.73a130.65a124.83a117.57a100.10a117.06a106.69a102.88a

72.26b

注:表中同一行数据右上角相同字母表示差异不显著(P>0 05),不相同表示差异显著(P

Note:Thesuperscriptswiththesameletteronthesamelinemeanin-significantdifference(P>0 05),whilethedifferentlettersmeansig-nificantdifference(P

3 讨论

3.1 金属离子对缢蛏消化酶活力的影响

刘万顺等[9]在对紫贻贝(Mytilusedulis)、滨螺(Littorinasp.)消化酶活力的研究中发现,紫贻贝的淀粉酶、蛋白酶活力较高,纤维素酶活力较低,主食浮游单细胞藻类;并认为不同种类动物体内同一功能的消化酶活力与动物的遗传性和食性有关。本实验测得缢蛏胃和消化盲囊中具有淀粉酶、纤维素:

第4期 吴众望等:9种金属离子对缢蛏消化酶活力的影响299

纤维素酶活力,3种消化酶活力基本反映出缢蛏对食物消化利用的能力。缢蛏的主要饵料为浮游性弱而易于下沉的硅藻和底栖硅藻等,其消化酶的测定结果与紫贻贝的类似。

表3 金属离子对缢蛏淀粉酶活力的影响

Table3 AmylaseactivitiesofSinonovaculaconstrictaunder

effectsofdifferentmetalions

金属离子MetalionAg+Ca2+Cu2+Fe3+Hg2+Mg2+Mn2+Pb2+Zn

2+

抑制作用、Mg2+、Fe3+的促进作用和Mn2+的无显著影响,与本实验不同。对于淀粉酶,Hg2+、Ag+的抑制作用和Mg2+的无影响,与本实验相同;而Cu、Pb的抑制作用和Fe、Ca、Zn、Mn的促进作用,与本研究结果不同。Vega-Villasante等[11-12]2+

2+

3+

2+

2+

2+

对加州对虾(Penaeuscaliforniensis)消化酶

-2

2+

2+

的研究表明,在1 10mol/L浓度下,Mg、Ca对蛋白酶活力无影响,Hg2+、Zn2+对淀粉酶活力有明显的抑制作用,与本实验类似;而1 10-2mol/L的Hg2+、Zn2+、Cu2+对蛋白酶活力有抑制作用,5 10mol/L的Mg、Ca对淀粉酶活力具有促进作用,又与本实验的结果不符。可见,金属离子对不同种类生物消化酶的作用效果并不完全一致,对同种贝类的不同消化酶作用也不同,对同种贝类的同类消化酶(如淀粉酶和纤维素酶)影响也有很大差异。

3.2 金属离子对缢蛏消化酶影响机制的探讨现已证实,金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力,从而导致酶活性的改变,有些能对酶活性产生抑制作用,有些则激发酶的催化功能。有毒金属离子与酶之间可能存在着2种作用形式。即有毒金属离子置换酶活性中心的必需金属;或有毒金属离子结合酶分子中的咪唑基、巯基、羟基、氨基、肽基等功能基团,从而导致酶失活。本实验表明,9种金属离子对缢蛏3种消化酶活力的影响表现出不同的变化趋势,这可能是由于金属离子对不同消化酶的作用机制不同。

据Bryan等[14]报道,疣鲍(Haliotistubarcula-ta)的消化盲囊对Ca、Mg、Fe具有极高的累积作用。崔毅等[15]研究了乳山湾菲律宾蛤仔(Ra-ditapesphilippinaram)、牡蛎(Oystersp.)体内重金属含量。结果表明Cu、Zn在其体内含量较高时,贝类仍能正常的存活与生长,这说明贝类对某些金属离子有一定的累积作用和适应性。本实验中Cu2+在2 10-3mol/L和Zn2+在2 10-5mol/L浓度下(已分别超出中华人民共和国渔业水质标准约10000倍、10倍)对缢蛏淀粉酶活力均表现出促进作用,由此表明某些金属离子可提高贝类的摄食和消化吸收功能,促进其生长。同时还应注意到,有毒重金属离子通过贝类食物链对人类的危害作用。因此,深入研究金属离子对贝类消化酶的影响机制,开展贝类的洁净养殖生产和有针对性的脱毒暂养,[16]

2+

2+

2+

2+

3+

[13]-3

2+

2+

金属离子浓度/(mol L-1)Concentrationofmetalion 02 10-62 10-52 10-100a100ab100a

71.15b89.52bc

59.76b

4

2 10-32 10-242.38c82.79c

33.16c99.05abc84.65a16.93d

73.61a42.24d88.58a85.78

d

68.46b

40.71d111.42a

100ab180.36cd133.54bc100a133.87b100a73.39a100a 7.80b100

a

74.35a192.20c124.88abd

33.37c68.57a58.34c97.05a75.19

d

52.41b175.40c114.71a109.59a

96.35a134.42b72.76a73.67a10.92b148.81

c

44.32cd95.70a84.76

d

100a102.13a109.05a

20.75

b

注:表中同一行数据右上角相同字母表示差异不显著(P>0 05),不相同表示差异显著(P

Note:Thesuperscriptswiththesameletteronthesamelinemeanin-significantdifference(P>0 05),whilethedifferentlettersmeansig-nificantdifference(P

表4 金属离子对缢蛏纤维素酶活力的影响

Table4 CellulaseactivitiesofSinonovaculaconstrictaunder

effectsofdifferentmetalions

金属离子MetalionAgCaCu

+2+2+

金属离子浓度/(mol L-1)Concentrationofmetalion 02 10-62 10-52 10-100104.65100100

aaa

aaa

4aab

2 10-32 10-263.9894.2597.75

baa

99.7790.3891.03

aaab

107.43101.1983.44

64.9597.37

ba

97.9199.95

47.73c72.09b

Fe3+Hg2+Mg2+Mn2+Pb2+Zn2+

100a105.31a101.63a104.20a111.02a

100a104.65a100.31a102.43a57.22b43.76c100a110.02a102.01a117.52a115.86a103.99a100a154.35b119.69a138.13ab127.92ab188.05c100a146.41b151.40b129.79b129.00b100a

97.04a103.05a106.19a101.29a

93.59a99.42a

注:表中同一行数据右上角相同字母表示差异不显著(P>0 05),不相同表示差异显著(P

Note:Thesuperscriptswiththesameletteronthesamelinemeanin-significantdifference(P>0 05),whilethedifferentlettersmeansig-nificantdifference(P

[5-6]

杨惠萍等研究了皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)的消化酶,结果认为2 10-3mol/L浓度下,Zn2+、Ca2+、Pb2+对其蛋白酶无显著影响,与2+

+2+

300 中国水产科学 第10卷

[9] 刘万顺,李 濒.海洋无脊椎动物消化酶的研究I:紫贻贝、日

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Effectsofninemetalionsondigestiveenzyme

activitiesofSinonovaculaconstricta

WUZhong-wang,PANLu-qing,DONGShuang-lin

(TheKeyLaboratoryofMarineCultureofMinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Abstract:Theconcentrationsofninemetalions(Cu、Mg、Fe、Hg、Zn、Ca、Pb、AgandMn)

weredesignedat2 10-6mol/L,2 10-5mol/L,2 10-4mol/L,2 10-3mol/Land2 10-2mol/L,re-spectively,andtheSinonovaculaconstrictasampleswereemployedwithshelllengthat4.25-6.85cm.After48hstarvation,theactivitiesofprotease,amylaseandcellulaseintheS.constrictawereanalyzedbyusingen-zymeanalyticalmethod.TheresultsindicatethattheactivityofamylaseinS.constrictaisthehighestamongthethreedigestiveenzymes,andtheactivityofproteaseishigherthanthatofcellulase.Withintheexperimentalconcentrationrange,Cu2+,Fe3+,Mg2+andPb2+havenosignificanteffects,whereasHg2+,Zn2+,Ca2+,Ag+andMnhavesignificanteffectsonproteaseactivityofS.constricta;MgandPbhavenosignificanteffects,whereasCu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+,Ca2+,Ag+andMn2+havesignificanteffectsonamylaseactivity;Ca2+,Mg2+andZn2+havenosignificanteffects,whereasPb2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Ag+andMn2+havesignificantef-fectsoncellulaseavtivity.Theactivitiesofprotease,amylaseandcellulaseinS.constrictashowdifferentvaria-tionpatternsunderthedifferentconcentrationsofmetalions.

Keywords:metalions;Sinonovaculaconstricta;protease;amylase;cellulose

2+

2

2+

2+2+3+2+2+2+2++2+