真核生物基因的获取

真核生物目的基因的获取

基因工程流程的第一步就是获得目的基因，如何获得目的基因就成为基因工程的关键问题。 所谓目的基因就是已被或者将要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有：物理化学法、化学合成(人工合成)法、逆转录(cDNA文库)法、基因文库法、PCR法。

一、 物理化学法

DNA双链结构的特点和四种碱基互补的氢键差异，是理化方法分离基因的依据，其方法有以下三种：密度梯度离心法,单链酶法,多聚赖氨酸法。

1、 密度梯度离心法

研究发现，rDNA和tDNA基因不但存在许多重复单位，而且含有较多的G和C，所以比一般的DNA密度大，而且较重，利用CsCl密度梯度离心法进行离心就可使这类DNA在离心管内较低位置形成区带，收集后就可获得这类基因。

2. 单链酶法

由于DNA分子中G-C对比A-T对稳定，加热变性时，A-T多的部位先变性，双链解开，再用S1核酸酶切去单链部分，经超速离心处理，就可得到GC含量高的基因。用这种方法已分离出GC含量高达63%的海胆rDNA。

3. 多聚赖氨酸法

人工合成的赖氨酸多聚体能与AT含量高的DNA结合，发生沉淀。利用这一特性，可将DNA混合物中AT含量高的DNA沉淀后除去，再进行分离纯化就可得到GC含量高的rDNA和tDNA。

二、 化学(人工)合成法

如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出为该多肽链编码的核苷酸序列，就可以利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。一般用于小分子活性多肽基因和引物的合成，对于分子量较大的目的基因，可通过分段合成，然后通过连接酶连接组装成完整的基因。目前，利用该法合成的基因已有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡汰及干扰素基因等。

三、逆转录(cDNA文库) 法

该法主要用于合成分子量较大而又不知其序列的基因。它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，再在DNA聚合酶作用下合成双链cDNA，与适当载体结合后转入受体菌，扩增后即为cDNA文库。然后，采用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的基因。目前，cDNA文库的类型：普通cDNA文库、全长cDNA文库、均一化cDNA文库、全长均一化cDNA文库。

四、基因文库法

基因文库的构建是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。首先，用限制性内切酶将某一种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都含有特定的基因组DNA片段。存在于转化菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合就称为基因组文库(genomic library)或基因文库(gene library)。从理论上讲，这些重组子应包含整个基因组DNA序列，即包含了某种生物细胞的全部基因。基因文库的构建一般包括五个基本步骤：①细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片段连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。

五、基于PCR的基因克隆

PCR一般步骤： ①变性(denaturation)，即将模板DNA置于94-95℃的高温下，使双链解开变成单链DNA；②退火(annealing)，将反应体系的温度降到45-65℃左右，使一对引物能分别与变性后的两条模板链互补配对 ；③延伸(prolong)，将反应体系温度调整到72℃(以Taq DNA聚合酶为例)，合成新的DNA链。若干循环后，目的DNA分子就会得到迅速扩增。PCR引物类别：特异引物、同源引物、简并引物、随机引物。

1. 普通特定PCR

知道目的基因的全序列或两端的序列，可根据其两端序列设计特定的引物进行PCR扩增。

2. 反向PCR

反向PCR (Inverse PCR, I-PCR)是一种根据已知序列扩增其旁侧序列的方法，适用于已知序列旁侧启动子等调控序列的扩增。已知序列可以是cDNA或EST(表达序列标签)序列，设计引物时应在外显子区(不应落在外显子拼接点上或内含子区)，且经常会在引物5’端加上一个酶切位点和几个包含碱基，如GCTAGAATTCAGCTGATCTGAGCTTATC(红色标注的为EcoR I酶切位点)。

3. 锚定PCR

锚定PCR (Anchored PCR)是一种根据已知序列扩增其旁侧序列的方法，适用于已知序列旁侧启动子等调控序列的扩增。由此发展了cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA End, RACE)技术。

4. 差异表达基因的获取

根据两种组织或不同生理、病理、环境条件下同种组织之间的差异，可以利用许多方法筛选出差异表达的基因。常用的有： 差异显示反转录PCR (Differential Display Reverse Transcription, DDRT-PCR)、代表性差式分析(Representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)等。