仪器分析在医药的应用
仪器分析在药物分析的应用
班级:12食品 姓名:李娜 学号:12110217
【摘要】近年来,随着仪器分析在医药领域应用越来越广泛,越来越多的的新技术新方法被应用在医药制造分析方面,本文对医药领域方面的仪器分析应用整理并统一综述。
【关键词】仪器分析 医药应用制造 高效毛细管电泳 应用
【正文】
高效毛细管电泳(HPCE)又叫毛细管电泳(CE),是必高压电场为驱动力,以毛细管及其内壁为通道和载体,利用样品各组分之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。目前已广泛应用于生命科学、生物技术、临床医学、药物学和环境保护等领域。采用HPCE 法能数秒至数分钟内可冲洗再生,不易污染,能直接进样水溶性蛋白样品。此外,它呵在185~210nm 波长下进行监测,因其避免了高效液相色谱仪(HPLC)在短紫外波长测定时易受到所用溶剂截止波长的干扰,这样就可测定分子中不带生色团的药物,扩大了监测范围[1],这些优点与传统药物分析方法相此更突出了HPCE 在这一领域巾的优势地位,使毛细管电泳在体内药物分析领域有着极其广阔的应用前景。
1. 概述
1.1 电泳及其发展介绍
电泳是带电粒子在电场力作用下,以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象. 称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同,迁移速率不同,可实现分离。1937年,蒂塞利乌斯将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白;发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定;第一次的自由溶液电泳;第一台电泳仪;1948年,获诺贝尔化学奖。
1.2 传统电泳和高效毛细管电泳的比较
传统电泳:(纸电泳,凝胶电泳等)操作烦琐,分离效率低,定量困难,无法与其他分析相比。高效毛细管电泳(HPCE):是指离子或带电粒子以毛细管为分离室, 以高压直流电场为驱动力, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进:一是采用了0.05mm 内径的毛细管;二是采用了高达数千伏的电压。
1.3 HPCE的特点
高灵敏度:常用紫外检测器的检测限可达10-13-10-15mol ,激光诱导荧光检测器(LIF)则达10-19-10-21。
高分辨率:每米理论塔板数为几十万,高者可达几百万乃至几千万。
高速度:许多分析可在10分钟内完成,有的可在60秒内完成。
所需样品少:只需纳升(10-9升) 的进样量。
成本低:只需少量(几毫升) 的流动相和低廉的毛细管。
应用范围广:除分离生物大分子(肽、蛋白、DNA 和糖等)外,还可用于小分子(氨基酸、药物等) 及离子(无机及有机离子等) ,甚至可分离各种颗粒(如硅胶颗粒等) 。
2. 高效毛细管电泳的原理
2.1 CZE的基本原理
HPCE选用的毛细管一般内径约50um(20um~200um) ,外径375um ,有效长度50cm(7cm~100cm) ,以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间浓度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其结构包括一个高压电源,一根毛细管,一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。HPCE 所用的大理石英毛细管柱,在pH>3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流二致,故最先流出;中性粒子的电泳流速度为“零”,故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
2.2 MECC的基本原理
MECC是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠,SDS) 加到缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电,但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相) 之间产生分配,中性粒子因其本身疏水性不同,在二相中分配就有差异,疏水性强的和胶束结合牢,流出时间就长,最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC 使HPCE 能用于中性物质的分离,拓宽了HPCE 的应用范围,是对HPCE 极大的贡献。[2]
3. 高效毛细管电泳仪
3.1仪器流程与主要部件
包括电脑控制系统和主机,主机有进样系统,分离系统和检测系统。
电泳仪工作示意图
工作流程如下:移开进样端的缓冲溶液池→换上样品管→进样 →再换上缓冲溶液池→加上分离电压,电泳→检测。
3.2各系统详述
3.2.1进样系统
3.2.1.1流体力学进样方式
进样端加压,出口端抽真空,虹吸进样。
3.2.1.2. 电动进样方式
毛细管一端插入样品瓶,加电压;进样定量参数:流体力学方式-压力和时间(mbar ·s ), 电动进样方式-电压、电流或功率和时间, 进样量要求:样品区带的长度应该小于毛细管总长度的1-2%(长度相当于几个毫米、体积相当于1-50nl )
3.2.2分离系统
毛细管:目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。内径通常为20~75μm, 外径为350~400μm ,常用的有效长度为50~75cm;恒温系统:控制柱温变化在±0.10C ;高压电源:电流0~300μA ,电压0~30KV,稳定、连续可调的直流电源,电压稳定性在±0.1%。
3.2.3检测系统
紫外-可见光检测,二极管阵列检测。此外,荧光,激光诱导荧光,质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳。
4. 高效毛细管电泳应用中存在的缺陷及改进方法
4.1定量精密度较差。
在用毛细管电泳做定量检查时,所得数据的RSD 值通常较大,常采用内标法, 以提高其定量精密度。如Davydova[3]等以氨基苯甲酸为内标法测定小鼠尿液、血浆中的碘他拉酸盐,
结果测定低浓度碘他拉酸盐时,5份样品的准确度为98.0%,RSD为6.4%,测定高浓度时, 准确度为99.7%,RSD为0.8%。
4.2 灵敏度较低。
在用毛细管电泳法对样品痕量物质的检查时,一方面组分浓度较小,另一方面检测器,进样方法的差限,导致灵敏度较低。随HPCE 的不断完善, 提高灵敏度的措施也愈来愈多。目前,提高毛细管电泳检测灵敏度的措施主要有3种[4]:样品的预处理.采用更高灵敏度的检测器,采用样品浓缩技术。
4.2.1样品的前处理
样品的前处理是提高灵敏度的重要措施,在体内药物分析中, 常见的样品有血浆、血清、尿液和头发等, 为避免样品中的蛋白质和盐等基质对分析测定的干扰, 常需对样品进行预处理。HPCE 对样品的预处理要求, 没有HPLC 和GC 那么严格。常用的预处理方法有沉淀法和萃取法。
沉淀法中,当待测物浓度足够大时, 可离心进样或经简单离心过滤后进样。若样品中含盐和蛋白质, 可用在柱微渗析或小孔聚丙烯酰胺凝胶将待测物与上述基质分离。待测物分子较小且与高浓度蛋白质混合时, 可用超滤法或排阻色谱法分离。
萃取法主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE),这2种萃取方法都是基于待测物质在两相之间分配行为的差异, 都适用于基质干扰较大, 待测组分数量较多, 尤其是含脂溶性成分较多的样品。也有将液-液萃取与固相萃取相结合, 在消除样本中杂质的同时, 可以提高检测灵敏度, 如测定血清中R-和S-司可巴比妥[5]的含量就采用此法。其最低检测限(LOD)达到1μg/ml。
4.2.2 样品浓缩技术的采用
样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离,从而提高检测灵敏度的一种技术 ,毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分。
柱上浓缩是改变毛细管电泳系统时进行,特大体积样品直接引入分离色细管后,在电泳前采取适当的措施进行浓缩,然后直接进电泳分离;柱前浓缩是在改变毛细管电泳系统时进行 一般往分离毛细管前增加一段预柱,大体积样品首先被引人预柱中采取适当措施进行浓缩,然后部分或全部被引入分离毛细管柱中进行分离。Eap 等[6]采用FASS 技术对血样中的四类抗抑郁药物进行富集,测定了米安色(mianserin)、去米安色林、8一羟基米安色林及其对映体的血药浓度。在进样前以流体动力进样法引入一小段水柱,加压到5kV 后该区场强增高,使待测物快速迁移入毛细管。在水柱和背景电解质交界处进行富集。米安色林和去甲米安色林的LOQ 为5Lg /L ,8一羟基米安色林的LOQ 为15Lg /L 检测快速,适用于治疗药物监测。
4.2.3 采用更高灵敏度的检测器
CE 常用紫外-可见检测器,但是检测光程受毛细管内径的限制, 毛细管内径小于100um ,检测光程短,当采用一般通用型紫外检测器时,灵敏度只能达到10-6mol/L[7]。常用的紫
外检测器的检测浓度一般要求样品的进样浓度在10-5mol/L以上,这对于纯药品的测定或实验室进行的研究来说或许不成问题, 但在实际应用中, 药品中杂质的含量大都只在0.1 %左右, 浓度过低, 难以达到被检测的水平[8]。除紫外-可见检测器外,近年来,CE 采用了激光诱导荧光检测器,它是CE 中最灵敏的检测器。另外还有质谱检测器,质谱检测器与其他检测器相比是一种更为通用型检测器,它的选择性和专属性弥补了CE 中样品迁移时间变化的不足,能给出分子量和结构信息,使检测具有二维性。最近我国开发的固液化学发光体系[9]使CE 的在柱检测灵敏度提高到10-8mol/L ,并成功地应用于分离和检出ABEI 标识的氨基酸。
5. 药物分析上的应用
药物分析大致可分为二大部分:一是原药的定量, 原药中不纯物的测定、药剂的分析以及对它们的稳定性的评价等以药品质量管理为目的的测试方法。这些方法要求有良好的选择性, 适当的分析灵敏度和可靠的准确度等。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究, 即临床药物分析。这里我们主要讲体内药物分析部分。
5.1治疗药物检测
维生素 维生素是人体机能不可缺乏的一类化合物, 它所包含的种类相当多, 一般分为水溶性维生素和脂溶性维生素。水溶性维生素大多是以离子形态存在于溶液中, 可以采用CZE 法进行分离分析, 如果遇到混合样品中含有电中性的维生素试样时, 则必需选用MEKC 分离方法, 如烟酸以及它的代谢物具有较强的亲水性, 尽管这一类化合物中有个别代谢物在水溶液中以中性分子存在, 但它们在水中良好的溶解度可以应用MEKC 达到分离的目的[11]。 解热镇痛药、抗组胺药、消炎药和止咳药 这些药物常用于治疗感冒头痛。这些化合物大部分在溶液中是电中性或不溶于水, 比较适合采用MEKC 法, 早在90年代初寺部等[12]对12种感冒药成分的分离进行了研究, 发现5种不同的直链烷基阴离子表面活性剂的极性功能团对分离的选择性有很大的影响。市售的解热镇痛药片中的无水咖啡因、扑热息痛等用MEKC 进行分离与定量, 回收率接近100%,相对标准偏差低于2%[13]。有关这一方面的应用报道, 近几年来逐渐增加, 特别是添加有机溶剂、环糊精或混合表面活性剂使MEKC 法所能适用的样品范围得到扩大。
降压药 以普萘洛尔为代表的降压药物, 分子内含有苯乙醇胺骨架, 大多数的化合物呈碱性(pH 10左右), 所以用阳离子表面活性剂MEKC 法分离这一类化合物相当适用。如用MEKC 法分离测定了尿样中10 种β2阻滞剂的含量[14] 以及血清样品中9种β2阻滞剂的浓度
[15],尿样测定结果的相对标准偏差在7 %以内, 但对血清测定结果的相对标准偏差则偏高, 大部分在10%左右, 最高达15.8%,这也表明对于成分越复杂的样品, 测定结果的误差可能性越大, 在这一点上,CE 与其它方法是相同的。
抗生素、合成抗菌剂 抗生素、合成抗菌剂大多以离子形态存在于溶液中, 适用于CZE 法。如用0.15mol/L硼酸作为电泳液(pH9.4)对硫酸庆大霉素进行分离与定量[16],针剂中的3 种有效成分的移动时间的相对标准偏差为5 %,定量结果的相对标准偏差为2.1%~3.6%,与微生物定量法的结果一致。另外, 头孢拉定以及所含的主要杂质头孢氨苄的分析, 采用MEKC 法可以得到良好的分离[17],比较了9批头孢拉定冲剂的HPLC 和MEKC 分析结果, 两组的数据非常相近, 测定结果的相对差值在-1.66%~0.22%之间。
5. 2 滥用药物
将HPCE 用于滥用药物分析, 在毒品检验、戒毒工作方面有独特的优势。有些吸毒者虽然在短期内停止吸毒, 在尿样或血清中检测不出毒品, 但对于它们头发中痕量[18]可卡因、吗啡仍可用CZE 检测出, 以确定其有无吸毒史。
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