质粒提取试剂盒提取步骤

质粒提取试剂盒提取步骤

1、 用1.5 ml离心管收集5-6 ml菌液。12,000 rpm离心1min,弃上清。

● 应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数,确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分,纯化时会影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2 、加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。 ● 初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于 4℃保存。可保存6 个月。 ● 不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA 得率的高低。

● 室温静置1-2 min 是为使溶液中的RNA 被充分降解。

3 、加入250 μl溶液Ⅱ,轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

● 若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA 的纯化结果。

● 不可剧烈混和,否则会使染色体DNA 断裂。

● 此步骤不宜超过5 min。

4、 加入350 μl溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5 、12,000 rpm 室温离心10 min,收集上清。

6 、将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2 min。

● 如果收集的上清液过多,超过DNA 纯化柱容积(800 μl),可将上清分次加入DNA 纯化柱中。

7、 12,000 rpm 离心1 min,弃滤液。

● 此时质粒DNA 被吸附于DNA 纯化柱的硅胶膜上。

8 、加入500 μl 溶液HB(异丙醇),12,000 rpm 离心1 min,弃滤液。

● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。

9 、加入500 μl溶液Wash DNA buffer,12,000 rpm 离心1 min,弃滤液。

● 溶液W 初次使用前用无水乙醇按1: 1.5 稀释,即含60%乙醇。

10、 加入500 μl溶液Wash DNA buffer,12,000 rpm 离心1 min,弃滤液。

11、 12,000 rpm 离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体,置凉5min挥发残留酒精。

12 、将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加50-100 μl 溶液Eluent,室温放置2 min。

● 12,000 rpm离心1 min, 管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA 于-20℃保存

● 溶液 Eluent 可用无菌双蒸水代替,但其pH 需为8.0-8.5。溶液Eluent 的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。


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