蒲公英根多糖的分离_纯化及结构的初步分析

受热时间，故减少了Res分解的机会，保证了Res较高的产率。

为了加快Res的提取速率，笔者在实验过程中对比了搅拌、爆气和泵循环3种促进溶媒流动方式，结果发现爆气这种方式易提供一种富氧环境而导致Res氧化分解，所得产品中Res的含量最低，泵循环和搅拌的提取效果相当，但是从工业化连续生产的实际和车间布置的方便性考虑，搅拌更适合于工业化生产。

在实验过程中，笔者考察了虎杖药材的粉碎粒度对提取效率的影响，发现粉碎粒度越小，Res的提取效率越高，然而，粒度越小其固液分离越难进行，过滤操作时间越长，故综合考虑生产过程的可操作性和Res的提取效率，选择将虎杖药材粉碎至20~40目粉末。

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收稿日期：2009-12-18

蒲公英根多糖的分离、纯化及结构的初步分析

高金波，孙丽娜，滕杨，侯巍*(佳木斯大学药学院，黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的 提取蒲公英根多糖，并对该多糖进行分离、纯化和结构的初步分析。方法 采用超声波协同酶法进行提取多糖，分离纯化后，经Sephadex G-75柱分成A，B，C，D4级，采用优化的PMP柱前衍生HPLC分析单糖组成。采用紫外、红外等方法进行结构的初步分析。结果 4种多糖均含有D-鼠李糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和D-阿拉伯糖；它们的单糖的摩尔比依次为，A：0.098∶2.88∶0.125∶0.01∶0.33；B：0.113∶0.68∶0.13∶ 0.011∶0.19；C：0.139∶2.46∶0.36∶0.13∶0.086；D：0.028∶0.36∶0.031∶0.012∶0.94。结论 4种多糖在结构上有明显的不同。 关键词：蒲公英；多糖；结构

中图分类号：R284.1 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2010)10-0905-04

Isolation, Purification and Analysis of Glycoprotein from Taraxacum Polysaccharides

GAO Jinbo, SUN Lina, TENG Yang, HOU Wei*(The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department

Helongjiang, College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To extract polysaccharides from the root of Taraxacum and then isolate, purify and analyze the structure of polysaccharides. METHODS Polysaccharides were extracted by ultrasonic and coordinated enzyme methods, after separating and purifying, four levels (A, B, C, D) were fractionated by Sephadex G-75 column and then monosaccharide constituents were analyzed by HPLC applied to PMP precolumn derivation. Preliminary analysis of structure was analyzed by UV, IR method. RESULTS All of the four kinds of monosaccharides contain D-rhamnose, glucose, D-galactose, D-xylose and

基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题(2007-510)

作者简介：高金波，女，教授 Tel: (0454)6557559 E-mail: [email protected] *通信作者：侯巍，男，教授 Tel: (0454)6557527E-mail: [email protected]

JMAP, 2010 October, Vol.27 No.10 ·905· 中国现代应用药学2010年10月第27卷第10期 Chin

D-arabinose. Their molar ratios are as follow in turns: Fraction A: 0.098∶2.88∶0.125∶0.017∶0.33；B:0.113∶0.68∶0.13∶ 0.011∶0.19;C:0.139∶2.46∶0.36∶0.13∶0.086; D: 0.028∶0.36∶0.031∶0.012∶0.94. CONCLUSION It showed that there were significant differences in four species of polysaccharides. KEY WORDS: Taraxacum; polysaccharide; structure

蒲公英是菊科属多年生的草本植物，又名黄

花地丁、婆婆丁、黄花郎等。现在的研究表明蒲公英的化学成分不仅有挥发油、黄酮类、三萜类、香豆精类和倍半内酯类，而且富含甾醇、棕榈酸和多糖[1]。多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，因其具有能量储存、结构支持、防御和抗原决定性等多方面的生物学功能，而且有些多糖或其衍生物还具有多种药理活性，所以近年来多糖成为天然药物研究与开发的一个热点[2-4]。本试验对研究较少的蒲公英根中的多糖进行了结构方面的初步研究。 1 仪器及试剂

蒲公英根(河北省安国市京华药业有限公司，批号：071222，由佳木斯大学生药学教研室刘娟教授鉴定为蒲公英根)；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ZORBAX-C18分析柱(美国Agilent公司)；UV 757型紫外分光光度计(上海精

密科学仪器有限公司)；三氟乙酸(TFA，纯度≥99%)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，在使用之

前用色谱纯甲醇重新结晶2次)，葡萄糖(Glc，含量≥99%，批号：080322)，D-鼠李糖(Rha，含量≥99%，批号： 061103)

，D-半乳糖(Gal，含量≥99%，批号：080506)，D-木糖(Xyl，含量≥99%，批号：071212)，D-阿拉伯糖(Ara，含量≥99%，批号：070811)均来自国药集团化学试剂有限公司；甲醇、

乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。 2 实验方法

2.1 超声波协同酶法提取、分离及纯化

蒲公英根粉碎后，用石油醚、80%的乙醇回流脱脂、脱低聚糖，于50 ℃热风干燥，称取适量的蒲公英根，1∶40的料液比，纤维素酶为底物的3%，提取温度为50 ℃，提取时间为25 min，pH=5.0，用超声波法进行提取，提取液浓缩至总

体积的1/3时，Sevage法除去蛋白，大孔吸附树脂进行脱色，95%乙醇进行沉淀，低温干燥得到蒲公英多糖。

2.2 蒲公英根中多糖的分级

称取蒲公英多糖用浓度为0.05 mol·L−1 NaCl溶液配成10 mL的饱和溶液，离心，取上清液进

·906· Chin JMAP, 2010 October, Vol.27 No.10 行上样，用Sephadex G-75柱层析进行分级处理，洗脱液分别为0.05，0.1，0.15，0.2 mol·L−1的NaCl溶液，用苯酚-硫酸法检测，收集反应阳性的高峰部分，将收集得到均一多糖溶液用体积分数为95%的乙醇进行醇析，离心，制得蒲公英精制多糖A，B，C，D。

2.3 蒲公英根多糖的组成分析

2.3.1 混合标准单糖的衍生 分别精密称取Glc 0.039 6 g、Gal 0.036 3 g、Xyl和Ara各0.030 0 g、Rha 0.036 4 g，溶于10 mL氨水中，取该溶液100 μL与100 μL PMP/甲醇溶液(0.5 mol·L-1)混合，在70 ℃下反应30 min，取出后冷却至室温，用1 mL

氯仿萃取，充分振荡后除去有机相，重复3次。水溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，用水稀释一定量的倍数后，进行HPLC分析。

2.3.2 蒲公英根多糖的衍生 准确称取蒲公英精制多糖5 mg，加入2 mol·L−1TFA溶液1 mL封管，110 ℃水解2 h，得到多糖的水解样品溶液，取多

糖水解液100 μL按“2.3.1”项下“与100 μL PMP/甲醇溶液(0.5 mol·L−1)混合”开始，进行衍生化处理。 2.3.3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1

mol·L−1磷酸盐缓冲液(pH 6.7)-

乙腈(83∶17)；流速：1 mL·min−1；检测波长：245 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

2.4 蒲公英多糖结构初步分析的方法

2.4.1 紫外光谱分析 称取精制多糖样品适量，用蒸馏水配制成一定浓度的溶液，以蒸馏水为空白，在200~400 nm内进行扫描。

2.4.2 红外光谱分析 取精制多糖样品适量，用KBr压片，扫描范围为4 000~400 cm−1。

3 结果与讨论

3.1 蒲公英多糖的分级检测的结果

用Sephadex G-75柱层析进行分级处理得到A，B，C，D，将收集到的蒲公英多糖溶液于490 nm处以苯酚-硫酸法逐管检测，根据测定结果，以

管号为横坐标，以每管中蒲公英多糖溶液的浓度为纵坐标绘制出洗脱曲线，蒲公英多糖层析的洗脱曲线见图1。

中国现代应用药学

2010年10月第27卷第10期

化，优化结果为磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)的pH为6.7时，采用等度洗脱的分离模式能够使以上5种单糖衍生物得到较理想的分离见图2A。 3.2.2 衍生方法的优化 已报道的方法中[5-7]，多采用以NaOH溶液(低温、密闭保存)作介质，取样品溶于该溶液，然后取该溶液与PMP/甲醇溶液混合，在70 ℃下反应30 min，冷却至室温后，加入与NaOH

图1 蒲公英多糖的洗脱曲线

1−A组分；2−B组分；3−C组分；4−D组分

溶液相同量的HCl进行中和，真空干燥至干，用水及氯仿溶解充分震荡后除去有机相，重复3次，水相溶液经离心后，用水稀释，进行HPLC分析。

本试验用氨水进行衍生，无需对反应后的溶液进行中和，直接用氯仿萃取，用水稀释后进行HPLC分析。简化了实验步骤、缩短了样品的处理

Fig 1 Elution curves of the Taraxacum polysaccharides

1−A componet; 2−B componet; 3−C componet; 4−componet

3.2 分级多糖的组成分析结果

3.2.1 色谱条件的优化 为实现蒲公英多糖各组成单糖的高效分离，本试验对蒲公英多糖中可能含有的Glc，Rha，Gal，Xyl，Ara 5种标准单糖PMP衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优

时间，避免了干燥后的衍生物由于难溶而引起的误差，结果使定量更加准确，见图2B；从图的纵坐标可看出优化后峰高均增加近1倍多。多糖样品的色谱图见图2C

。

图2 高效液相色谱图

A−单糖标准品PMP衍生物(有干燥过程)；B−单糖标准品PMP衍生物(无干燥过程)；C−多糖样品；1−PMP；2−Rha；3−Glc；4−Gal；5−Xyl；6−Ara

Fig 2 HPLC chromatogram

A−the PMP derivatives of the monosaccharide standards (with drying); B−the PMP derivatives of the monosaccharide standards (without drying); C−sample of polysaccharides; 1−PMP; 2−Rha; 3−Glc; 4−Gal; 5−Xyl; 6−Ara

3.2.3 多糖的单糖组成 精制蒲公英多糖A，B，C，D中均Rha，Glc，Gal，Xyl，Ara等5种单糖，

可以看出，糖类分子中含有大量的外光谱图见图3。

-OH，O-H伸缩振动多在3 200~3 600 cm−1之间出现

它们的单糖的摩尔比依次为，A：0.098∶2.88∶0.125∶0.017∶0.33；B：0.113∶0.68∶0.13∶0.011∶0.19；C：0.139∶2.46∶0.36∶0.13∶0.086；D：

强而宽的吸收峰。蒲公英多糖在3 421 cm−1有强而宽的吸收峰，为O-H的伸缩振动峰；2 943 cm−1出

0.028∶0.36∶0.031∶0.012∶0.94，除此之外，还

含有其他多种单糖。 3.3 多糖紫外光谱测定结果

分级后的蒲公英多糖在260 nm和280 nm处均没有吸收峰，说明蒲公英多糖不含有核酸和蛋白质，在其他波长处无特征吸收峰，符合多糖类化合物的结构特点。 3.4 多糖红外光谱测定结果

用不同浓度NaCl溶液洗脱获得蒲公英多糖红

图3 蒲公英多糖红外光谱图

Fig 3 IR spectra of Taraxacum polysaccharides

JMAP, 2010 October, Vol.27 No.10 ·907·

中国现代应用药学2010年10月第27卷第10期 Chin

现弱吸收，为C-H伸缩振动峰；在1 700~400 cm−1有明显的不同的吸收，说明4种多糖在结构上有明显的不同。

3.5 提取蒲公英多糖的选材

实验前期分别采用蒲公英的根、花、叶各部分分别进行了蒲公英多糖的提取、分离和纯化，并且所得到用苯酚-硫酸法对多糖的总糖含量进行测定，的多糖含量大小关系为：根>花>叶，与付学鹏等[8]研究中各器官所测得多糖的含量顺序相同，所以本试验直接选用蒲公英根作为提取多糖的原材料。

多糖的研究是各个国家的研究热点，我国科研工作者也做了大量的研究工作。目前在蒲公英的研究报道中主要有多糖提取、分离、纯化、脱色、脱蛋白、降糖药理作用等方面，在蒲公英多糖的组成和结构分析研究尚未见报道。因此，本试验着重蒲公英多糖的组成和结构分析进行了初步研究，为开发利用蒲公英提供参考。

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收稿日期：2009-12-23

GC双内标法同时测定细辛挥发油中5种成分的含量

范少楼1，刘利萍波 315100)

1,2*

，边可君

1

(1.绍兴文理学院化学化工学院药学系，浙江 绍兴 312000；2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁

摘要：目的 建立毛细管气相色谱法同时测定细辛挥发油中5种主要成分(α-蒎烯、β-蒎烯、1, 8-桉叶素、黄樟素和甲基丁香酚)的方法。方法 采用挥发油提取器提取挥发油；以胡薄荷酮和间二甲苯为双内标物，用HP-5毛细管柱分离，火焰离子化检测器检测；以保留时间定性，内标法定量。结果 在所选择的色谱条件下，上述成分在12 min内获得较好的分离；5种成分与内标物的峰面积比值与其质量浓度有良好的线性关系，r>0.997 7；样品加标平均回收率为96.7%～99.4%，RSD为1.24%～2.31%。结论 本方法简单、快速、准确，可同时测定细辛挥发油中5种成分的含量，为细辛质量控制提供依据。

关键词：气相色谱法；双内标法；细辛挥发油；活性成分

中图分类号：R917.101；R927.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2010)10-0908-04

Determination of Five Active Constituents of Asiasarum Essential Oil with Capillary Gas Chromatography by Using Double-Internal Standard Method

FAN Shaolou1, LIU Liping1,2*, BIAN Kejun1(1.Department of Pharmacy, College of Chemistry and Chemical

Engineering, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China; 2. College of Biological Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

作者简介：范少楼，男，实验师 Tel: (0575)88342813 E-mail: [email protected] Tel: (0575)88526099 E-mail: [email protected]

*

通信作者：刘利萍，女，博士，教授

·908· Chin JMAP, 2010 October, Vol.27 No.10 中国现代应用药学2010年10月第27卷第10期