脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳

近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。电泳结果通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理

PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子

DNA得以分离。 图l是根据Carle和Olson

最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1

field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的

PFGE示意图。A、B代表两个交替开启和关

闭的电场。当A电场开启时，B电场关闭，

DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )

移动；当B电场开启时，DNA分子改变原

来的运行方向，随B电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子 图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场 即呈“Z” 字形向前移动。目前的理论和实验

研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。如果电场方向改变 DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。此外还发现，当交替变化的两个电场方向的夹角大于90°时，DNA能较迅速地将其后端调转过来，在新的电场中成为泳动的前端。但另一方面，由于DNA分子是顺长度穿越凝胶孔的，当电场方向突然改变时，分子的两端可能同时伸入不同的凝胶孔，折为U形或J形结构而被阻隔下来。只有当新的前端移向更前方时，另一端才能被牵拉下来。因DNA分子具有很大弹性，当某一端挂在凝胶孔时， DNA分子拉长， 滑落下来后又收缩，并很快赶上前端。但当电场强度太大时，大分子DNA因带有均匀的电荷，电场力的作用将可能使同一DNA大分子的多个部位同时进入多个凝胶孔，结果被陷住而不再向前移动。这就是在分离人酵母菌(S．pombe)染色体等大分子时要用低电场的原因。

二 PFGE在分子生物学中的应用

PFGE是一种非常有效的分子分型方法。在国外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究中。能够用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源，在疫情控制方面可发挥重要的作用。具体表现在以下几个方面：

1 研究菌株之间的遗传差异。

2 在表面上散在分布的病例中寻找可能的联系，通过监测及时发现暴发。 当今传染病暴发流行的性质发生了改变，即：暴发流行不再局限于某一地区，一段相对集中的时间里，由同一污染源引起的暴发流行，而是由多个传染源．在较长的时间段内，跨越省市甚至是国家的暴发流行。脉冲场凝胶电泳方法由于其自身优势而被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的暴发流行，还有助于识别散发病例的传染源。

3 可用于对已确认的爆发疫情进行传染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。

4 除了帮助流行病学调查外．细菌分型还能对病人的诊断和治疗提供线索，对连续继发性感染患者分离菌株进行PFGE分析可以区分是复发(单一菌株型)还是新的菌株引发的再感染。

5 PFGE也用于抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型，如耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌和耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)。

6 对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株进行相关性分析。 7 PFGE还可用于其他领域， 如百日咳抗原性变异和PFGE的相关性。

三、脉冲场凝胶电泳的方法

（1） 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工 1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）

5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10． 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11． 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。

12． 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13． 若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。

（2）大小标准物的制备 1）λ多联体

1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。

2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。

3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。

2）酵母染色体

1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml

YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。

2．4000×g转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。

3．仍以4000×g转速离心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重悬。

4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。

5．溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40μl SCE溶液中含5×107个细胞（相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞）。

6．溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀，37℃保温15～30min。

7．细胞悬液与等体积的SCE配制的2％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50℃。

8．将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9．凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1～2小时。

10． 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃温育48h。

11． 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次，每次20min。

12． 凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。

（3）琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化 1．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。

2．在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。

3．混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100 mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），10～20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。

4．设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。

5．将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。

7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。

（4）凝胶电泳

1．将0.8％的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子 2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。

3．用1％液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25×TBE配制）密封狭槽。

4．若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。

5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6．应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。

7．电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。

8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。

9．凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。

10．用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA脱嘌呤，并有利于转移。

11．凝胶用碱（变性溶液中）变性20min，两次，续以中性溶液1～5min。

12．采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h）

四、脉冲场凝胶电泳的分类

1．InCert琼脂糖----兆碱基片断DNA制备获准使用的琼脂糖。

是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA样品的低胶凝温度琼脂糖。研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶消化。

⊙应用：脉冲场凝胶电泳。

⊙分析说明：胶凝温度（1.5%）：26℃-30℃

硫酸盐：≤0.15% 凝胶强度(1.0%)：≥400g/cm 2

熔化温度（1.5%）：≤70℃

湿度：≤10% EEO(-Mr)：≤0.10

2．SeaKem Gold琼脂糖

是一种高凝胶强度，低EEO，标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学术级别（Genetic Technology Grade，GTG）琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）快速分辨Mb（megabase）

（50kb-10Mb）DNA和常规电泳方法分辨1-50kb的DNA与PCR产物。因其低EEO特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。PFGE的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的50%。因其高凝胶强度，即使是使用低浓度（0.5%）的SeaKem Gold琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片断并减少PFGE中的DNA分离的耗时。

⊙应用：脉冲场凝胶电泳； 标准凝胶电泳分离大于23kb的DNA片断；Mb大小DNA印迹。

⊙分析说明：

胶凝温度（1.5%）:34.5℃－37.5℃

硫酸盐：≤0.10%

凝胶强度(1.0%)：≥1800g/cm2

凝胶强度（1.5%）：≥3500g/cm2

湿度：≤10% EEO(-Mr)：≤0.05

五 PFGE结果的解释

Tenover等提出了有关菌株同源性的判别标准，按其电泳条带可分为：无差异，说明为相同菌株；有1～3条带的差异说明菌株间有相近关系，且只有单基因的改变；4～6条带的差异说明菌株间可能有相近关系，表示出有两个独立基因的差异；如菌株间有6条带或更多条带差异，说明有三个或更多基因的变化，被视为无相关性。该标准只适合于小量的局部性基因的变化研究。有一定的局限性。

因为细菌的高变异性，判断是否是同一菌株时允许一定的变异存在，因此在解释PFGE结果时，将具有85％ 以上相同条带的菌株认为是相同的菌株，50％ 以上的条带不相同时，菌株被认为流行病学不相关。另外还有一些研究者提出了

不同的判断原则。如利用相关系数(CS)来评价不同菌株的基因型之间的关系。即CS=两个细菌间相同的基因带数×2／两个细菌的基因带数的总和。CS

六 PFGE的影响因素

PFGE受很多因素的影响：

1 缓冲液的种类、浓度和温度的影响

缓冲液中的离子浓度越低，电泳跑得越快。Buffer缓冲液的温度影响整个电泳时间和结果，缓冲液的温度越低，电泳跑的越慢，得到的条带越细直，结果越理想。目前认为14℃能得到最好的电泳带型。

2 电泳时脉冲角度的重要性

使用较小的角度，如106°来改善染色体DNA 的分离状况；使用较小的角度，可以把电泳时间减少50％；随着角度的减小，较大的片段分离的更好，更理想，较小的片段分离的效果降低。因此要根据分离片段大小来调整脉冲角度。

3 电泳时脉冲时间的重要性

脉冲时间就是电极在单一方向改变所需要的时间，如30s的脉冲时间即为电极在单一方向受脉冲作用30s，然后在另一个方向作用30s。为了得到理想的PFGE图像．脉冲时间是最重要的参数。为了分离小片段的样本，通常减小脉冲时间；为了分离大片段的样本，通常增大脉冲时间。

4 电泳过程中电压梯度的影响

电压梯度反映电场的强度(V／cm)，大多数CHEF协议认为：对于850 kb左右的DNA片段，6 V／cm的电压梯度最适宜；处理大于3 Mb的DNA时，使用

1.5～3 V／cm，以及一个较小的电泳角度；处理小于250 kb的DNA时，使用9 V／cm，以及一个较小的电泳角度；调整脉冲时间以达到理想的电泳效果。

七 PFGE方法的局限和不足

1 耗时。随着PFGE方法的不断完善，部分菌属周期长的缺点已逐渐为一种快速PFGE方法(24～48 h)所克服。

2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，故需要较高的技术水平。

3 并不是对所有情况都适合。Brain等认为，PFGE有时不能区分同一地区一段时间内的散发病例。这可能是由于这些病例来源于同一菌株的原因。

4 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。

5 结果得到的是条带，而不是序列。

6 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。

泳动距离相同的片段并不总是具有同源性的基因。因此，脉冲场凝胶电泳分析对于大小相似的片段分辨率不是很高。

7 不同条带之间并不是无关的、相互独立的，而是互相联系的。

8 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。

9 PFGE得到的亲缘关系只能起到一个指导作用，而不是真正意义上的种系发生量度。暴发可能由同种细菌的多个亚型引起，因此仅仅PFGE图谱的差异不能说明菌株不是来自共同的传染源。流行病学结论应该结合流行病学调查结果和其他分子分型资料才能最终确定疾病的传染源。

10 有些菌种用PFGE是不可分的。C．Foucault等发现对于有广泛基因重组现象的细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。

尽管如此，PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生物学分析中还是得到了广泛的应用，也是目前最推崇的方法之一。在近几年里，许多实验室采用此方法进行流行病学分析，显示了其强大的功能和可应用性。