融合细胞HAT筛选原理
单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT 选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H )、氨基喋呤(A )和胸腺嘧啶核苷酸(T )。其依据是细胞中的DNA 合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT 培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA 合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT )和胸腺嘧啶核苷激酶(TK )催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT 培养液中,未融合的效应B 细胞和两个效应B 细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d 左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT )细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B 细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT 培养液中选择性存活下来,并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B 淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B 淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT 培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。
相关文章
- HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
- 2.2动物细胞工程教学案
- 安徽理工大学医学院
- 生物技术制药BBS
- 特异性抗原抗体的应用及展望
- 单克隆抗体技术历史与发展简述
- 分子生物学试题及答案 1
- 单克隆抗体的制备
- 单抗制备的详细步骤
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理 HAT培养基是指含有次黄嘌呤(hypoxantin).氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质的细胞培养基. 1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径 (1)起始合 ...
2.2 动物细胞工程 2.2.1 动物细胞培养和核移植技术 [课标要求] 1.简述动物细胞培养的过程.条件及应用. 2.比较动物细胞培养与植物组织培养区别. 3.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景. [本节重难点] 1.动 ...
安徽理工大学医学院 (教案续页) 基 本 内 容 由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体,为单克隆抗体(McAb).其理化性状高度均一,抗原结合部位和同种型都相同,生物活性专一,特异性强,纯度高,有效抗体含量高,无效蛋白含量少, ...
筛选阳性重组体的技术 举例"说明对酶的修饰 名解: 1.DNA ligase 2.cosmid 3.transduction 4.嵌合抗体 5.cloning vector 6.immobilized cell 简答: 1.怎样改 ...
特异性抗原抗体的应用及展望 院系:生物工程 专业:生物技术 姓名:邵明洋 学号:[1**********] 特异性抗原抗体的应用及展望 摘要 抗原的特异性是物质之间相互吻合性或针对性.专一性.抗原的特异性表现在免疫原性和抗原性两方面.抗原结 ...
单克隆抗体技术历史与发展简述 陈 光 (首都师范大学生物系北京100037) 1 单克隆抗体技术的研究背景 单克隆抗体(monoclonalantibody,shortforMcAb)技术(简称单抗),又被称为肿瘤 能直接导向肿瘤的药物.1 ...
分子生物学试题及答案一.名词解释 cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA. 1.cDNA与cccDNA:cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA: 2.标准折叠单位:蛋白质二级结构单元α-螺旋与β-折叠通过各种连接多 ...
单克隆抗体的制备 一. 单克隆抗体技术的原理 B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化.增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力.B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的.将这种B细胞与非分 ...
单克隆抗体研制最详细步骤 单克隆抗体的研制 一.单克隆抗体的概念 常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分.一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定所以常规抗体也是 ...