克隆载体与表达载体
一部分:概念解析
二部分:问题解答
克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。
表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
(RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由 3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字,命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。
由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补,因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark
sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境,避免ribosome出现leaky scan)
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。
1.载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。
2. 载体的分类
按功能分成:(1)克隆载体: 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体 :具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs
等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分:(1)原核载体(2)真核载体(3)穿梭载体(sbuttle vector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
问题:
基因工程中有克隆载体和表达载体,克隆载体可以在受体菌中大量复制,表达载体用于表达目的蛋白,那么实际应用中,我们的最终目的是要得到目的蛋白,克隆载体不能完成表达,有何用呢?还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后,再将其转移到表达载体中实现表达?它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能?构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难?
回答:
1.克隆的目的比较单一,就是将你感兴趣的DNA片段,重组进入载体,然后于宿主细胞中大量繁殖,主要用于各种文库的建立,比如人类基因组计划;同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的,而克隆载体没有表达所需的各种片段,所以可以容纳更长的目的片段,即可以克隆足够长的基因,效率更高。
2.重组DNA需要使用限制性内切酶,因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点,现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物,省去了两端加装识别位点的设计,PCR效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的,为了实现实际工作中的需要,不同的目的就要设计不同的载体,用表达载体克隆基因不是不可以,实际工作中要考虑更多,因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的,如果用来合成大量蛋白质,合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的,给它的工作太多,效率必然低下,这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单,不是不能,是完全可以,但是效率会低很多。所以我们一般的策略是,将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上,按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统,如有问题可以继续来信讨论,希望对你有所帮助。
1) 您好!
您博文里得“T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物,省去了两端加装识别位
点的设计,PCR效率就更高。”是什么意思?
博主回复:2009-10-16 09:51:51
T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T,而Taq酶有在PCR产
物后随机加A的特性,所以PCR产物直接可以接入T载体。而经典的克
隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体,所以在设计PCR引物时
两端要加酶的识别位点,而加装的序列与模板不配对,因此PCR效率会低
很多。
2) 老师,您好!
您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因,而现在多用PCR就可以达到这个目的。那这个目的基因的主要用途是什么?只用来测序吗? 表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧?
博主回复:2010-03-20 13:07:05
嗯,基本是这个意思。就测序不克隆也可以进行,克隆到载体的CMS中
就在基因两端有了可供你选择的很多限制性酶切位点,方便亚克隆到各种
表达载体上。当然表达载体可以克隆,但是效率低于克隆载体。一是因为
表达载体不能直接克隆PCR产物,必须加装限制性酶切识别序列,上面已
经讲过。二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒,就是每
个细菌里的拷贝数较低,能量守恒,细菌摄取能量的能力是一定的,用来合成蛋白质,核酸的合成必然受一定得限制。
3) 老师您好,我要构建一个基因的载体,
1.我可以将目的基因(1.3kb左右)和表达载体分别作酶切后连接吗?这几天将目的基因做了一个T载体连接,可是不知道下一步怎么利用?
2.设计引物的时候用了sac1和hind111,做pcr的时候可以用pfu酶吗?pfu酶是必须的吗?
3.我选择的表达载体上sac1和hind111的酶切位点只是相差两个碱基,做双酶切的时候能切开吗?
回复:
1.如果你的目的基因已经在T载体上,当然可以分别酶切后连接,但是要注意方向。
2.如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。T载体可以直接连接PCR产物源于其末端错加的A,所以不能使用高保真的PFU。但是你的扩增片段较长,如果用一般的TAQ酶,合成中可能会出错,用PFU准确度高,需要设计酶切位点。如果PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体,不必借助T载体。文献上有报道,按1:1的比例混合使用PFU和TAQ效果更好。
3.应该能切开,因为设计引物时保护碱基也就2到3个,但是最好稍微距离远一点。
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