双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十 蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的
学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理
在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材
[试剂]
1.双缩脲试剂: 取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解,再加2.5mol/L NaOH溶液300ml,KI 1.0g,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现,即不能使用。
2.标准蛋白质溶液: 用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
[器材]
1.试管:15×150mm 试管7只;
2.1ml,5ml移液管; 3.坐标纸 ; 4.721分光光度计。
四、实验操作
混匀,37℃水浴20分钟,冷却至室温,在分光光度计波长540nm处,用空白管调零,读取各管吸光度值。1~5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度,在标准曲线上求得蛋白质浓度。
[注意事项]
1.双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2+
形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3∶1,加入KI作为抗氧化试剂。
2.双缩脲试剂要封闭贮存,防止吸收空气中的二氧化碳。
3.本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响,唯一缺点是灵敏度较低。
4.黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。 [思考题]
1.双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量? 2.请用双缩脲法,设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。
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