液相色谱实验原理部分

有机污染物高效液相色谱分析技术

 仪器型号：Agilent 1200 HPLC高效液相色谱

 仪器厂商：美国安捷伦公司

 仪器性能： 流速范围：0.001~5.0mL/min,0.001mL/min步进；压力范围：0-40MPa(0-400bar,0-5880psi)；梯度组成精密度：

 样品要求：样品一般需预处理。

 实验目的：掌握高效液相色谱分析法的工作原理及本仪器的基本操作。 实验课程要求：

1．课前预习：样品的前处理方法（上样要求）、仪器原理、仪器操作规程等。

2．实验期间严格遵守“实验室仪器使用须知”及液相色谱操作规程使用仪器。

3．撰写实验报告（内容应包括实验目的、基本原理、仪器与试剂、实验步骤、实验数据记录、结果与讨论、回答思考题等）。

一、实验目的（1）

1．掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理）。

2．基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作。

3．了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用范围。

4．掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。

实验目的（2）

1．掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、二极管阵列检测器检测原理）。

2．基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作。

3．了解二极管阵列检测器的基本原理和特点，基本掌握从三维图谱中找出化合物的最大吸收波长。

4．掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。

二、实验原理

分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。

C18柱-反相HPLC（reversed phase HPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。

紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。（Agilent 1200 UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm）

二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）工作原理：以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。（Agilent 1200 DAD全扫描波长范围为190nm-950nm）

Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）

以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。

外标法定量：外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。

三 、仪器及试剂

1、 仪器（1）：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18色谱柱（4.6*250mm，5um）)，稳压电源。

仪器（2）：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 DAD检测器、C18色谱柱（4.6*250mm，5um）)，稳压电源。

2、 试剂： 色谱级甲醇；Miniport超纯水；含5个苯类化合物的标准品；含3个酚类化合物的标准样品；实际测试水样（配制）

四、实验步骤：(见操作规程)

五、思考题

1、简述高效液相色谱分析的特点及应用范围。

2、流动相使用前为什么要脱气？

3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

4、为什么溶剂和样品要过滤?

5、高效液相色谱定性、定量的依据是什么？