液相色谱实验原理部分
有机污染物高效液相色谱分析技术
仪器型号:Agilent 1200 HPLC高效液相色谱
仪器厂商:美国安捷伦公司
仪器性能: 流速范围:0.001~5.0mL/min,0.001mL/min步进;压力范围:0-40MPa(0-400bar,0-5880psi);梯度组成精密度:
样品要求:样品一般需预处理。
实验目的:掌握高效液相色谱分析法的工作原理及本仪器的基本操作。 实验课程要求:
1.课前预习:样品的前处理方法(上样要求)、仪器原理、仪器操作规程等。
2.实验期间严格遵守“实验室仪器使用须知”及液相色谱操作规程使用仪器。
3.撰写实验报告(内容应包括实验目的、基本原理、仪器与试剂、实验步骤、实验数据记录、结果与讨论、回答思考题等)。
一、实验目的(1)
1.掌握高效液相色谱分析法中的基本原理(包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理)。
2.基本了解高效液相色谱(1200LC)组成结构,硬件操作及掌握化学工作站的开机,关机,参数设定,数据采集及分析的基本操作。
3.了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用范围。
4.掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。
实验目的(2)
1.掌握高效液相色谱分析法中的基本原理(包括分配分离原理、二极管阵列检测器检测原理)。
2.基本了解高效液相色谱(1200LC)组成结构,硬件操作及掌握化学工作站的开机,关机,参数设定,数据采集及分析的基本操作。
3.了解二极管阵列检测器的基本原理和特点,基本掌握从三维图谱中找出化合物的最大吸收波长。
4.掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。
二、实验原理
分配色谱原理:主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同(分配作用)而实现分离的液相色谱分离模式。
C18柱-反相HPLC(reversed phase HPLC):由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶,代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式,几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。
紫外-可见光(UV-VIS)检测器原理: 基于Lambert-Beer定律,即被测组分对紫外光或可见光具有吸收,且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团,有较强的紫外或可见光吸收能力,因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度,也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感,所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时,为了得到高的灵敏度,常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。(Agilent 1200 UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm)
二极管阵列检测器(diode-array detector, DAD)工作原理:以光电二极管阵列(或CCD阵列,硅靶摄像管等)作为检测元件的UV-VIS检测器,它可构成多通道并行工作,同时检测由光栅分光,再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号,然后,对二极管阵列快速扫描采集数据,得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是,普通UV-VIS检测器是先用单色器分光,只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池,然后通过一系列分光技术,使所有波长的光在接受器上被检测。(Agilent 1200 DAD全扫描波长范围为190nm-950nm)
Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程:输液泵将流动相(经过在线过滤器)
以稳定的流速(或压力)输送至分析体系,在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离,并依次随流动相流至检测器,检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。
外标法定量:外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时,则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积(或峰高)成正比。数据处理软件(工作站)可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线,由标准曲线求出被测物浓度。
三 、仪器及试剂
1、 仪器(1):Agilent 1200 HPLC(四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18色谱柱(4.6*250mm,5um)),稳压电源。
仪器(2):Agilent 1200 HPLC(四元泵、自动进样器、柱温箱、 DAD检测器、C18色谱柱(4.6*250mm,5um)),稳压电源。
2、 试剂: 色谱级甲醇;Miniport超纯水;含5个苯类化合物的标准品;含3个酚类化合物的标准样品;实际测试水样(配制)
四、实验步骤:(见操作规程)
五、思考题
1、简述高效液相色谱分析的特点及应用范围。
2、流动相使用前为什么要脱气?
3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理?
4、为什么溶剂和样品要过滤?
5、高效液相色谱定性、定量的依据是什么?
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