高效液相色谱仪操作手册(戴安全自动)

液相色谱操作规程-U3000(全自动)

一、操作前准备:

1.1流动相的配制:

1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。

1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜(0.45um )还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。

1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。

1.2对照品供试品处理:

1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品,用适当的溶剂(最好采用流动相或流动相的主成分)进行充分溶解(也可借助超声波进行超声溶解),使其浓度为0.1~1mg/mL(根据检测结果再适当调节溶液的浓度)。

1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜(0.45um )还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。

1.3色谱柱的选择:根据样品的性质选择适当的色谱柱。

二、开机:

2.1打开电源,打开仪器接线板电源开关;

2.2打开电脑显示器电源,打开电脑主机电源,启动电脑;

2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源;等待各个部件自检完成

2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动, 等显示“本地仪器控制器 运行空闲”, 关闭界面。

2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标(工作站主程序)。

2.6在左下方点击仪器,则在右边会自动显示该仪器控制面板

2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上) ;设置A 通道为100%,点击“冲洗”,然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”;(默认冲洗5分钟);然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡;排完气泡后关闭排液阀;

2.8设置流动相的比例及流速后,点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。

2.9在控制面板“自动进样器”控制框中,分别执行“灌注注射器”,“清洗缓冲环”,“清洗针外壁”, 执行“到进样位置”;(操作过程中注意注射器有没有气泡。如有先机器排气,如果不行手动拆除排气泡。)

3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中,设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。

3.1打开氘灯(待系统压力稳定后约10min 后再开灯):在控制面板“Detector ”控制框中,选中“紫外灯”选框,及“可见灯”选框(如果波长在可见范围)。

3.2 在控制面板“UV ”控制框中,设置波长,采集频率(10~20HZ);点击“监视基线”,选中通道1并确定。

3.3在控制面板“FLD ”控制框中,设置激发波长及发射波长,灵敏度适当(1~7);采集频率(10~20HZ);点击“监视基线(一般30min )”,选中通道Emission_1并确定。(若不需要荧光分析,可忽略此步骤)

三、样品分析:

3.1建立仪器方法:

3.1.1点数据键,选中仪器方法,点创建,选中仪器方法(HPLC ),出现对话框,点击下一步,在运行时间栏中填写样品所需要运行的时间,选择所需的通道(若没有要选的通道,点击取消选择所有通道),点击下一步,进入pump (泵)设置,点击常规设置,填写溶剂名称(例如A :乙腈 B:水 放置流动相根据情况而定 ),设置压力限值(下限50 上限350)点击旁边的流速梯度,进入梯度设置,删除平衡阶段,设置流速为(1.0ml/min),按要求填写流动相比例;点击下一步,进入sampler (采样器)设置,将进样冲洗改为AfterDraw(其他设置不用改变) ,点击下一步,进入ColumnOven (柱温)设置,一般无要求通常设置为:温度30C ;下限5.0;上限110.0;平衡时间0.5min ;就绪温度差1.0C ;点击下一步,进入UV (紫外)设置,设置按要求所需的紫外波长(通道1),峰宽0.05;点击下一步;进入FLD 设置(荧光检测器),若不用蒸发光则不需开FLD ;点击下一步,出现对话框,将所需要做的样品名称填写上,点击完成后,再点击左上角保存,即可。全部设置完成后,点击仪器,出现主界面,点击Pump ,将流动相比例改成之前设置的比例,再点击UV ,将紫外波长改为要求的波长。

注:如需要进行梯度洗脱,则每个时间段的流动相比例不一样,进入泵设置的流速梯度,删除平衡阶段,按要求和时间段填写流动相比例,(每次按要求的时间再延长十分钟且流动相比例与最初0分钟的保持一致)。如果之前有创建,可以直接调用之前的。

3.2建立序列:

3.2.1点击数据键,点序列,创建一个样品文件夹,再点击序列,点创建,点击序列,点击HPLC ,点下一步,出现对话框,填写进样名称(样品名)、样品数、进样次数、开始位置、进样量;点击下一步,出现对话框,在浏览中选择所需要的仪器方法(上一步创建仪器方法),点击下一步,点完成,在对象名称栏中填写样品名称,点保存,出现序列,在名称栏中填写所做的样品名称(注明批号),类型栏中填写校准标准品(对照品)或未知(样品),级别栏默认数值,位置栏填写样品瓶的位置;进样量按要求填写所需的进样量,点击保存。

3.3待基线稳定后(一般30min) ,点击“监视基线”,点击确定,关闭查看基线。

3.4 将对照品及样品按序列中的位置逐个放在样品盘中;

3.5点击左下方“数据”,并选中要分析的序列,然后点击“开始”启动样品表进行分析(如果序列里有完成的样品,则会变成继续,点继续;如果该序列还在队列中则会显示删除,点击删除后在点击继续);

3.6样品全部检测结束后,如果不再分析样品应立即关掉氘灯,延长氘灯使用的寿命。

四、数据处理

4.1 方法一:在序列里选择所需要处理的数据双击,点击处理键,出现对话框,选中积分区域,点下一步直到完成。

4.2 方法二:双击图谱在数据处理界面点击校准和数据处理方法,进入界面,在色谱图下方点击“检测”,运行cobra 向导执行检测参数的优化, 选中要积分的峰,依次进行积分区域、基线噪声(可选择较平滑的一段)、平滑度、最小峰面积通道和进样类型进行选择直至完成。

4.3 打印图谱:点击报告设计器,点总结即可看到所建序列里所有数据;点击旁边的积分,点击页面布局,点页面预览,点击打印,即可。

4.4 打印样品报告。

五、关机:

5.1样品全部检测结束后,如果不再分析样品应立即关掉氘灯,延长氘灯使用的寿命,冲洗色谱柱(如果使用了缓冲盐,首先使用10%甲醇水溶液冲洗色谱柱

30分钟,然后使用纯甲醇冲洗色谱柱30分钟或用设定的智能关机系统自动冲洗,具体操作步骤:点击仪器,点击一起方法,找到仪器方法中C-10%甲醇-D 复制粘贴到序列,添加一个序列,将类型栏改为空白,仪器方法设为C-10%甲醇-D )。

5.2关闭泵马达,断开连接,关闭工作站。

5.3双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“停止仪器控制器”, 等显示“本地仪器控制器 已停止”, 可以关闭界面。

5.4关闭检测器、柱温箱、自动进样器、泵的电源。

5.5关闭计算机。关闭电源。

六、注意事项:

6.1溶剂泵的使用注意事项:

(1) 使用时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转会磨损柱

塞、缸体和密封环,最终产生漏夜。

(2) 防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其他任何杂质微粒都会磨损

柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体

颗粒。流动相过滤,可采用滤膜(0.2um 或0.45um )等滤过。

(3) 输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变

形,产生漏夜。

(4) 流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果

有大量的气泡,

泵就无法正常工作。

(5) 溶剂泵长期不用时,用甲醇以1.0ml/min冲洗各个通道。

(6) 泵的清洗液要勤换。

(7) 每次开启泵之前要排除管道中是气泡。

(8) 流动相由无机盐溶液转换有机溶剂前要用90%去离子水清洗管路。

(9) 转换不同流动相时注意两者是否容易混合或者发生反应。

(10)长期不用或运输前要到空清洗液瓶。

6.2色谱柱的使用注意事项:

(1) 免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色

谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也

会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,进样阀的转动不能过缓。

(2) 一般说来色谱柱不能反冲,只有生产厂家指明该柱可以反冲时,才可

以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

(3) 选择使用适宜的流动相(尤其是pH ),以避免固定相被破坏。有时可

以在进样器前连接一预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析之前被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被破坏。

(4) 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进

行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是有相似固定相的短柱,也有用浸透限制固定相短柱。保护柱可以经常更换。

(5) 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥

发干燥。绝对禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或更长时间。

6.3检测器的使用注意事项:

(1) 长时间检测池中无流动相流动时,关闭检测器氘灯。

(2) 不要将物品或其他仪器档住检测器的散热孔。

(3) 检测器安装的位置应没有震动,温度变化不大,避免阳光直射。

(4) 在关灯命令发出后,再次开灯须等待5分钟以上的时间。否则灯会因

为过热而损坏。


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